Neuroimagen. Técnicas y procesos cognitivos

Fernando Maestú Uturbe, Marcos Ríos Lago, Raúl Cabestrero Alonso

• Editorial: Elsevier Masson
• Año: 2007
• ISBN de la versión impresa: 9788445817766
• ISBN del libro electrónico: 9788445820872
• Categoría: Medicine
• Categoría: Internal Medicine & Diagnosis

- El presente manual, realizado por autores de prestigio tanto nacionales como internacionales, se centra en el estudio de las técnicas de neuroimagen funcional y del funcionamiento cerebral, tema del que hay una gran carencia de obras en lengua castellana.- Esta obra responde a preguntas como ¿Qué técnicas permiten aproximarnos al estudio del funcionamiento del cerebro? ¿Cuáles son sus posibilidades y limitaciones? ¿Qué resultados nos han dado en el estudio de los procesos cognitivos?, con un profundo rigor científico.- Consta de dos secciones bien diferenciadas. En la primera parte, dedicada a las técnicas, se describen las diferentes metodologías de estudio: microscopia electrónica, RM, en sus diversas variantes, PET, SPECT, EEG, MEG y algunas técnicas de estimulación, como la estimulación eléctrica cortical y la estimulación magnética transcraneal de alto y bajo campo. En la segunda parte, en la que se describen los Procesos, se hace una aproximación a las aplicaciones de estas técnicas en el campo de la neurociencia cognitiva y en concreto en el conocimiento de los sustratos neuronales de la memoria, la atención, el lenguaje, las funciones ejecutivas, el movimiento, la percepción, la emoción, así como las aproximaciones al estudio del desarrollo, la dislexia, las enfermedades psiquiátricas y la plasticidad en pacientes con daño cerebral.- Libro de enorme utilidad para estudiantes de psicología, así como para los de la carrera de medicina, y especialmente para residentes de neurología, neurocirugía, psiquiatría, radiología, neurofisiología y geriatría. Se trata igualmente de un perfecto manual de consulta para profesionales, incluso para los técnicos que manejan equipos de neurofisiología, radiología y medicina nuclear.- El comité editorial de la Universidad Nacional de Educación a Distancia ha dado su visto de calidad a esta obra.- Avalada por el comité editorial de la Universidad Nacional de Educación a Distancia, esta obra se centra en el estudio de las técnicas de neuroimagen funcional y del funcionamiento cerebral, tema del que hay una gran carencia de obras en lengua castellana.- Consta de dos secciones bien diferenciadas: en la primera parte, dedicada a las técnicas, se describen las diferentes metodologías de estudio: microscopia electrónica, RM, en sus diversas variantes, PET, SPECT, etc. En la segunda parte, se hace una aproximación a las aplicaciones de estas técnicas.- De enorme utilidad para estudiantes y profesionales de estas disciplinas, e incluso para los técnicos que manejan equipos de neurofisiología, radiología y medicina nuclear.

Parte I

Técnicas

1 Neuroimagen microscópica

J.I. Arellano Cabornero

Agradecimientos

Quiero expresar mi gratitud a las personas que han contribuido a la realización de este capítulo a través de la revisión crítica de sus contenidos y/o la generosa aportación de material gráfico: a Alfonso Araque, Inmaculada Ballesteros-Yáñez, Ruth Benavides-Piccione, Paola Bovolenta, Julián Morcillo, Javier DeFelipe Oroquieta, Pilar Esteve, Luis Miguel García Segura, Javier López-Ríos, Alberto Muñoz Céspedes, Gertrudis Perea, Carlos Portera-Cailliau, Roko Rasin y Nenad Sestan.

Introducción

La neuroimagen microscópica consiste en la observación del tejido nervioso a través de sistemas ópticos o electrónicos que permiten obtener imágenes a gran aumento para el estudio de su microestructura y organización. Con este fin se emplean microscopios de campo claro, de fluorescencia, confocal y multifotón, que emplean luz para la obtención de imágenes y que permiten una aproximación a la estructura tisular y celular del sistema nervioso. El microscopio electrónico resuelve los problemas de resolución que origina el uso de luz y utiliza radiación electrónica para obtener grandes magnificaciones y resolución a nivel molecular para desvelar la organización subcelular. Estos sistemas de microscopia necesitan un procesamiento previo del tejido, y se apoyan en el empleo de técnicas de tinción y marcaje selectivo de las muestras a estudiar, que permiten diferenciar los distintos componentes del tejido nervioso y estudiar su distribución, sus características morfológicas y bioquímicas, sus interacciones sinápticas y su fisiología.

En las últimas décadas, el desarrollo de marcadores fluorescentes compatibles con la fisiología celular, ha permitido la observación del tejido vivo, tanto in vivo¹ como in vitro,² empleando sistemas de microscopia de fluorescencia, particularmente el microscopio confocal y multifotón. Esta aproximación permite visualizar la dinámica de muchos procesos biológicos como la respuesta fisiológica celular en tiempo real, la migración neuronal o la sinaptogénesis durante el desarrollo cerebral, y de esta forma obtener una información mucho más completa acerca del funcionamiento del sistema nervioso. En este capítulo se sintetizan los fundamentos de los distintos sistemas de microscopia, sus capacidades y limitaciones, y se describen también las principales técnicas empleadas en neurobiología para identificar selectivamente los diferentes componentes del sistema nervioso y estudiar su estructura, organización, y fisiología.

Preparación del tejido para microscopia

El estudio microscópico del tejido nervioso implica una preparación de las muestras que incluye los pasos descritos a continuación.

Fijación

Procedimiento que impide que se produzcan fenómenos de degeneración post mortem, y permite, a su vez, que la estructura del tejido se mantenga de forma muy similar a como es en vivo. La fijación se consigue con la inmersión o perfusión del tejido con aldehídos como el formaldehído, paraformaldehído y glutaraldehído, que establecen puentes moleculares entre las proteínas estructurales y solubles del tejido, insolubilizándolas e inactivando las enzimas que darían lugar a la autólisis celular, con lo que se preserva la estructura del tejido. Se emplean distintos fijadores en función de las técnicas que se quiera emplear en el tejido, de modo que una fijación suave preservará gran parte de la actividad enzimática (v. «Técnicas histoquímicas»), mientras que una fijación normal (4% paraformaldehído) puede inactivar algunas enzimas pero conserva la mayoría de la antigenicidad del tejido (v. más adelante «Inmunohistoquímica »), y una fijación fuerte (2% glutaraldehído) generalmente inactiva enzimas y antígenos, pero genera una excelente preservación estructural, necesaria para los estudios de microscopia electrónica.

Seccionado

El tejido fijado es seccionado para su procesamiento y observación al microscopio. Las secciones suelen tener un grosor entre 4 μm y 100 μm, en función del tipo de estudio que vaya a realizarse. La obtención de secciones finas (por debajo de 30 μm) requiere dar firmeza al tejido mediante su inclusión en medios como parafina o celoidina. También se emplea la congelación del tejido para preservar sus propiedades biológicas a la vez que facilita la obtención de secciones finas. Las secciones gruesas, de 100 a 400 μm, se utilizan cuando es necesario mantener cierta integridad en las estructuras a analizar, específicamente de las neuronas o conexiones locales, como en el caso de las tinciones de Golgi, inyecciones intracelulares o cuando se realizan cultivos de tejido. Las secciones se realizan con la ayuda de microtomos o vibratomos, aparatos de precisión que permiten obtener cortes finos de un grosor homogéneo. En el caso de tejido congelado, se emplea un criostato, que es un microtomo que se encuentra dentro de una cámara que mantiene una temperatura de –20 °C para evitar la descongelación del tejido.

Montaje

Las secciones se montan en láminas de vidrio denominadas portaobjetos, cubiertas de albúmina o gelatina que permiten que las secciones queden adheridas a su superficie, y son teñidas según las diferentes técnicas que se describen en el apartado «Aplicaciones del microscopio de luz transmitida». En algunos casos la tinción se realiza previamente a su montaje en el portaobjetos.

Finalmente, las secciones son cubiertas con un medio de montaje transparente con un índice de refracción similar al del vidrio que presenta propiedades ópticas adecuadas para la observación microscópica (fig. 1-1). Este medio de montaje suele ser hidrófobo, lo que implica la deshidratación progresiva del tejido antes de incluirlo en el medio de montaje. En el caso de emplear marcadores fluorescentes, es necesario un medio de montaje hidrófilo (medios especiales, glicerol diluido) dado que la deshidratación elimina la fluorescencia. Por último, la preparación se cubre con una lámina muy fina (17 μm) de vidrio denominada cubreobjetos, que protege la muestra y permite obtener una superficie lisa y homogénea que evita las distorsiones ópticas (fig. 1-1).

Fig. 1-1 Montaje de muestras para microscopia óptica y electrónica. Microscopia óptica (A) sobre un portaobjetos de vidrio se coloca la muestra, se baña con un medio de montaje y se cubre con un cubreobjetos de vidrio. El medio de montaje presenta un índice de refracción similar al del vidrio y solidifica al secarse, permitiendo la conservación indefinida de la muestra. Microscopia electrónica de transmisión (B-D): dimensiones de una rejilla de ojal (B); rejilla de ojal cubierta con una membrana transparente sobre la que se montan las secciones ultrafinas, en este caso una serie de cortes consecutivos para poder seguir estructuras en secciones sucesivas (C); rejilla de malla sobre la que se han montado dos secciones: esta rejilla permite mayor estabilidad del tejido bajo el haz de electrones, pero limita el estudio del tejido a las ventanas que forma la malla (D).

Procesado para microscopia electrónica

El procesado del tejido para su visualización al microscopio electrónico presenta particularidades dadas sus especiales características. Así, la fijación suele realizarse con una mezcla de paraformaldehído y glutaraldehído, que produce una excelente fijación de las proteínas y los ácidos nucleicos. Además se emplea tetróxido de osmio, que permite una buena fijación de los lípidos, con lo que en conjunto se obtiene una óptima preservación ultraestructural. La observación al microscopio electrónico de transmisión requiere el empleo de secciones ultrafinas (v. más adelante «Microscopia electrónica»), por lo que es necesario incluir el tejido en resinas (epoxi, acrilato, glicol-metacrilato, etc.) que permiten obtener secciones de grosor homogéneo en torno a los 50 nm, empleando para ello un microtomo específico denominado ultramicrotomo y cuchillas especiales con filo de diamante. Las secciones obtenidas se montan en rejillas metálicas (fig. 1-1) que se introducen en el portamuestras del microscopio electrónico.

Microscopio de luz transmitida

También se denomina microscopio de campo claro, y emplea dos sistemas de lentes, el objetivo y el ocular (microscopio compuesto) para magnificar la imagen formada por la luz visible al atravesar el objeto de estudio. Consta de los siguientes elementos:

1. Una fuente de luz blanca, normalmente una lámpara halógena de wolfram...

Índice

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• Copyright
• Dedicatoria
• Autores
• Prefacio
• Table of Contents
• Parte I: Técnicas
• Parte II: Procesos
• Índice alfabético