Tierische Zellkulturen

Ein Methoden-Handbuch

R. Ian Freshney, S.-R. Goan, M. Schütt, H. Schunck, H. Wählte

• Publisher: De Gruyter
• Year: 2015
• Print ISBN: 9783110115604
• eBook ISBN: 9783110889024
• Edition: 1
• Topic: Biological Sciences
• Subtopic: Biochemistry
• Index: Biological Sciences

Table of contents

• Abkürzungsverzeichnis
• 1 Einführung
• 1.1 Geschichte der Gewebekultur
• 1.2 Vorteile der Gewebekultur
• 1.2.1 Kontrolle des Kulturmilieus
• 1.2.2 Charakterisierung und Homogenität der Probe
• 1.2.3 Wirtschaftlichkeit
• 1.3 Nachteile der Gewebekultur
• 1.3.1 Sachkenntnis und Erfahrung
• 1.3.2 Zellausbeute
• 1.3.3 Instabilität
• 1.4 In-vitro-Besonderheiten
• 1.5 Definitionen
• 2 Biologie der kultivierten Zelle
• 2.1 Kulturmilieu
• 2.2 Anlegen einer Zellkultur
• 2.3 Entwicklung von Zellinien
• 2.4 „Krise“ und Entstehung kontinuierlicher Zellinien
• 2.5 Entdifferenzierung
• 2.6 Was ist eine kultivierte Zelle?
• 2.7 Funktionelles Milieu
• 3 Planung und Einrichtung eines Gewebekulturlaboratoriums
• 3.1 Steriler Arbeitsbereich
• 3.2 Inkubation
• 3.3 Präparation und Vorbereitung
• 3.4 Reinigung
• 3.5 Aufbewahrung und Lagerung
• 3.6 Bauliche Gestaltung und Ausstattung
• 4 Laborausrüstung
• 4.1 Notwendige Laborausrüstung
• 4.1.1 Inkubatoren
• 4.1.2 Inkubationstemperatur
• 4.1.3 Dampfsterilisatoren
• 4.1.4 Kühl- und Tiefkühlschränke
• 4.1.5 Mikroskope
• 4.1.6 Reinigungsausrüstung
• 4.1.7 Heißluftsterilisatoren und Trockenschränke
• 4.1.8 Wasserreinigung
• 4.1.9 Zentrifugen
• 4.1.10 Kryokonservierung von Zellen
• 4.2 Nützliche Laborausrüstung
• 4.2.1 Laminarbox (Reinraumwerkbank)
• 4.2.2 Zellzählgeräte
• 4.2.3 Vakuumpumpen
• 4.2.4 CO2-Inkubatoren
• 4.2.5 Medienpräparation und Qualitätskontrolle
• 4.2.6 Mikroskope
• 4.2.7 Temperaturaufzeichnung
• 4.2.8 Magnetrührer
• 4.2.9 Rollerapparaturen
• 4.2.10 Pipettierhilfen und automatische Pipetten
• 4.2.11 Mechanische Hilfen und Automatisierung
• 4.3 Nützliche Zusatzgeräte
• 4.3.1 Tiefkühlgeräte
• 4.3.2 Spülmaschinen
• 4.3.3 Fernsehanlagen („closed-circuit television“)
• 4.3.4 Koloniezählgeräte
• 4.3.5 Zellgrößenbestimmung
• 4.3.6 Zeitraffer-Mikrokinematographie
• 4.3.7 Programmierbare Zelleinfriergeräte
• 4.3.8 Elutriationszentrifugen
• 4.3.9 Durchflußzytophotometer
• 4.4 Verbrauchsmaterial
• 4.4.1 Pipetten
• 4.4.2 Kulturgefäße
• 5 Technik des aseptischen Arbeitens
• 5.1 Ziele des aseptischen Arbeitens
• 5.2 Ruhige Zonen
• 5.3 Arbeitsflächen
• 5.4 Persönliche Hygiene
• 5.5 Pipettieren
• 5.6 Steriles Arbeiten
• 5.6.1 Abwischen
• 5.6.2 Verschließen
• 5.6.3 Abflammen
• 5.6.4 Gießen
• 5.7 Laminarbox (Reinraumwerkbank)
• 5.8 Standardprozedur des aseptischen Arbeitens
• 6 Sicherheit im Laboratorium und Biorisiken
• 6.1 Allgemeine Sicherheit
• 6.1.1 Glasgeräte und scharfe Gegenstände
• 6.1.2 Toxische Chemikalien
• 6.1.3 Gase
• 6.1.4 Flüssiger Stickstoff
• 6.2 Feuer
• 6.3 Strahlung
• 6.4 Biorisiken
• 7 Kulturbedingungen
• 7.1 Substrat
• 7.1.1 Glas
• 7.1.2 Einwegplastikmaterialien
• 7.1.3 Mikroträger
• 7.1.4 Sterilisation von Plastikmaterialien
• 7.1.5 Andersartige künstliche Substrate
• 7.1.6 Vorbehandelte Oberflächen
• 7.1.7 Feederschichten
• 7.1.8 Dreidimensionale Matrizes
• 7.1.9 Nichtadhäsive Substrate
• 7.1.10 Flüssig-Gel- und Flüssig-Flüssig- Grenzschichten
• 7.1.11 Perfundierte Mikrokapillaren
• 7.1.12 Kulturgefäße
• 7.2 Gasphase
• 7.2.1 Sauerstoff
• 7.2.2 Kohlendioxid
• 7.3 Medien und Supplemente
• 7.3.1 Physikalische Eigenschaften
• 7.3.2 Mediumbestandteile
• 7.3.3 Serum
• 7.3.4 Serumfreie Medien
• 7.4 Auswahl von Medium und Serum
• 7.4.1 Chargenreservierung
• 7.4.2 Prüfen von Serum
• 7.5 Sonstige Zusätze
• 7.6 Inkubationstemperatur
• 8 Vorbereitung und Sterilisation
• 8.1 Vorbereitung und Sterilisation von Geräten
• 8.1.1 Glasgeräte
• 8.1.2 Pipetten
• 8.1.3 Schraubkappen
• 8.1.4 Sonstige Gerätschaften
• 8.1.5 Alternative Sterilisationsmethoden
• 8.1.6 Auswahl der Detergenzien
• 8.2 Vorbereitung und Sterilisation von Reagenzien und Medien
• 8.2.1 Wasser
• 8.2.2 Physiologische Salzlösungen
• 8.2.3 Medien
• 8.2.4 Herstellung und Sterilfiltration sonstiger Reagenzien
• 8.2.5 Sterilfiltration
• 8.2.6 Sterilitätsprüfung
• 8.2.7 Wachstumstests
• 8.2.8 Lagerung
• 8.3 Gewinnung und Vorbereitung von Serum
• 9 Gewebedissoziation und Primärkultur
• 9.1 Isolierung des Gewebes
• 9.1.1 Mäuseembryonen
• 9.1.2 Hühnerembryonen
• 9.1.3 Menschliches Biopsiematerial
• 9.2 Primärkulturen
• 9.2.1 Kultur von Primärexplantaten
• 9.2.2 Enzymatische Gewebedissoziation
• 9.2.3 Dissoziation in warmem Trypsin
• 9.2.4 Trypsinierung bei 4°C
• 9.2.5 Organanlagen des Hühnerembryos
• 9.2.6 Andere enzymatische Methoden
• 9.2.7 Mechanische Dissoziation
• 9.2.8 Trennung lebender und nicht lebensfähiger Zellen
• 10 Haltung der Kulturen – Zellinien
• 10.1 Nomenklatur
• 10.2 Routinemethoden
• 10.2.1 Mediumwechsel
• 10.2.2 Volumen, Mediumtiefe und Oberfläche
• 10.2.3 Erhaltungsmedium
• 10.2.4 Mediumwechsel oder „Füttern“ einer Kultur
• 10.2.5 Subkultivierung
• 10.2.6 Vermehrung in Suspension
• 10.3 Schlechtes Zellwachstum
• 11 Klonierung und Selektion spezifischer Zellarten
• 11.1 Klonierung
• 11.1.1 Klonieren durch Verdünnung
• 11.1.2 Stimulation der Plattiereffizienz
• 11.1.3 Multischalen
• 11.1.4 Halbfeste Medien
• 11.1.5 Isolierung von Klonen
• 11.2 Selektionsmedien
• 11.3 Isolierung genetischer Varianten
• 11.4 Wechselwirkung mit dem Substrat
• 11.4.1 Selektive Anheftung
• 11.4.2 Selektives Ablösen
• 11.4.3 Beschaffenheit des Substrates
• 12 Physikalische Methoden der Zelltrennung
• 12.1 Methoden auf der Grundlage der Zellgröße und Sedimentationsgeschwindigkeit
• 12.1.1 Spontansedimentation bei 1 g
• 12.1.2 Elutriationszentrifugation
• 12.2 Methoden auf der Grundlage der Zelldichte
• 12.2.1 Isopyknische Sedimentation
• 12.3 Methoden auf der Grundlage der Fluoreszenz
• 12.4 Weitere Methoden
• 13 Charakterisierung von Zellinien
• 13.1 Einführung
• 13.1.1 Identifizierung der Spezies
• 13.1.2 Linien- oder gewebespezifische Merkmale
• 13.1.3 Unikale Marker
• 13.1.4 Transformation
• 13.2 Morphologie
• 13.2.1 Färbung
• 13.2.2 Kulturgefäße für zytologische Untersuchungen an Monolayerkulturen
• 13.2.3 Zytologische Untersuchungen an Suspensionskulturen
• 13.2.4 Photographie
• 13.3 Chromosomenanalyse
• 13.3.1 Chromosomenpräparation
• 13.3.2 Chromosomenbänderung
• 13.4 DNA-Gehalt
• 13.5 RNA- und Proteingehalt
• 13.6 Enzymaktivität
• 13.7 Antigenmarker
• 13.7.1 Indirekte Immunfluoreszenztechnik
• 13.7.2 Indirekte Peroxidasetechnik
• 13.7.3 Peroxidase-Antiperoxidase-Technik (PAP)
• 13.8 Differenzierung
• 14 Induktion der Differenzierung
• 14.1 Stadien der Determination und Differenzierung
• 14.2 Proliferation und Differenzierung
• 14.3 Determination und Differenzierung
• 14.4 Differenzierungsmarker
• 14.5 Induktion der Differenzierung
• 14.5.1 Lösliche Induktoren
• 14.5.2 Zelluläre Wechselwirkungen
• 14.5.3 Zell-Matrix-Wechselwirkungen
• 14.5.4 Polarität und Zellform
• 14.6 Differenzierung und Malignität
• 14.7 Praktische Aspekte
• 14.7.1 Präparation von Collagengel
• 14.7.2 BeSchichtung von Oberflächen mit vernetztem Collagen
• 15 Der transformierte Phänotyp
• 15.1 Was ist Transformation?
• 15.2 Anheftungsunabhängigkeit (Substratunabhängigkeit)
• 15.2.1 Klonierung in Suspension
• 15.2.2 Kontakthemmung und Dichtebegrenzung des Wachstums
• 15.2.3 Wachstum auf konfluenten Monolayern
• 15.3 Genetische Veränderungen
• 15.4 Zellprodukte und Serumabhängigkeit
• 15.4.1 Tumorangiogenesefaktor
• 15.4.2 Plasminogen-Aktivator
• 15.5 Invasives Wachstum
• 15.6 Tumorentstehung
• 16 Kontamination
• 16.1 Arten mikrobieller Kontamination
• 16.1.1 Kontrolle von Kulturen auf Mykoplasmen
• 16.1.2 Fluoreszenztechnik zum Nachweis von Mykoplasmen
• 16.1.3 Alternative Methoden zur Bestimmung von Mykoplasmen
• 16.2 Nachweis mikrobieller Kontamination
• 16.3 Kreuzkontamination
• 16.4 Schlußfolgerungen
• 17 Instabilität, Variation und Langzeitlagerung
• 17.1 Kulturmilieu
• 17.2 Selektives Wachstum, Transformation und Alterung
• 17.3 Genetische Instabilität
• 17.4 Kryokonservierung von Zellen
• 17.4.1 Auswahl einer Zellinie
• 17.4.2 Standardisierung von Medien und Serum
• 17.4.3 Einfrieren von Zellen
• 17.4.4 Auftauen der Zellen
• 17.5 Zellbanken
• 18 Quantitative Erfassung und ihre experimentelle Realisierung
• 18.1 Zellzählung
• 18.1.1 Hämozytometer
• 18.1.2 Elektronische Partikelzählung
• 18.1.3 Färbung der Monolayer
• 18.2 Zellmasse
• 18.3 DNA-Gehalt
• 18.3.1 Bestimmung des DNA-Gehalts von Zellen mit Hoechst 33258
• 18.3.2 Bestimmung des DNA-Gehalts von Zellen mit DAPI
• 18.4 Proteingehalt
• 18.4.1 Zellaufschluß
• 18.4.2 Proteinbestimmung nach Lowry
• 18.4.3 Proteinbestimmung nach Bradford
• 18.4.4 Proteinsynthese
• 18.4.5 DNA-Synthese
• 18.5 Vorbereitung von Proben für Enzym- und Immunoassays
• 18.6 Parallelproben
• 18.7 Wachstumszyklus
• 18.7.1 Latenzphase (lag-Phase)
• 18.7.2 Exponentielle Phase (log-Phase)
• 18.7.3 Plateauphase
• 18.8 Plattiereffizienz
• 18.9 Klonaler Wachstumstest mit der Verdünnungstechnik
• 18.10 Markierungsindex
• 18.11 Mitose-Index
• 18.12 Zellzykluszeit (Generationszeit)
• 18.13 Zytometrie
• 19 Zytotoxizitäts- und Vitalitätstests
• 19.1 Grenzen der In-vitro-Methoden
• 19.2 Art des Testsystems
• 19.2.1 Kurzzeittests (Vitalitätstests)
• 19.2.2 Langzeittests (Überlebenstests)
• 19.3 Mikrotitration
• 19.4 Metabolische Tests
• 19.5 Wechselwirkungen von Substanzen
• 19.6 Screening kanzerostatischer Substanzen
• 19.6.1 Prognostische Tests
• 19.6.2 Kultursysteme
• 19.7 Mutagenität
• 19.8 Karzinogenität
• 20 Kultivierung spezieller Zellarten
• 20.1 Epithelzellen
• 20.1.1 Epidermale Zellen
• 20.1.2 Mammaepithelzellen
• 20.1.3 Cervixepithelzellen
• 20.1.4 Darmepithelzellen
• 20.1.5 Leberparenchymzellen
• 20.1.6 Pankreasepithelzellen
• 20.1.7 Nierenepithelzellen
• 20.1.8 Bronchial- und Trachealepithelzellen
• 20.1.9 Prostataepithelzellen
• 20.2 Mesenchymzellen
• 20.2.1 Bindegewebszellen
• 20.2.2 Fettzellen
• 20.2.3 Muskelzellen
• 20.2.4 Knorpelzellen
• 20.2.5 Knochenzellen
• 20.2.6 Endothelzellen
• 20.3 Neuroektodermale Zellen
• 20.3.1 Neuronalzellen
• 20.3.2 Gliazellen
• 20.3.3 Endokrine Zellen
• 20.3.4 Melanozyten
• 20.4 Hämatopoetische Zellen
• 20.5 Keimzellen
• 20.6 Minimal-Deviation-Tumorzellen
• 20.7 Teratomzellen
• 21 Kultivierung von Tumorgewebe
• 21.1 Materialentnahme
• 21.2 Dissoziation
• 21.3 Primärkulturen
• 21.4 Charakterisierung
• 21.5 Entwicklung von Zellinien
• 21.6 Allgemeine Methoden
• 21.7 Selektionskulturen
• 21.7.1 Selektionsmedien
• 21.7.2 Selektive Substrate
• 21.7.3 Konfluente Feederschichten
• 21.7.4 Klonierung in Suspension
• 21.7.5 Histotypische Kulturen
• 21.7.6 Xenotransplantate
• 21.7.7 Kryokonservieren
• 22 Dreidimensionale Kultursysteme
• 22.1 Organkulturen
• 22.1.1 Gas- und Nährstoffaustausch
• 22.1.2 Strukturelle Integrität
• 22.1.3 Wachstum und Differenzierung
• 22.1.4 Grenzen der Organkultur
• 22.1.5 Arten von Organkulturen
• 22.2 Histotypische Kulturen
• 22.2.1 Schwammtechniken
• 22.2.2 Kapillarperfusion
• 22.2.3 Reaggregation und Sphäroide
• 22.2.4 Filtertechniken
• 23 Spezielle Techniken
• 23.1 Massenkulturtechniken
• 23.1.1 Suspensionskulturen
• 23.1.2 Monolayerkultur
• 23.2 Lymphozytenpräparation
• 23.2.1 Blastentransformation
• 23.3 Autoradiographie
• 23.4 Kultur von Poikilothermenzellen
• 23.5 Synchrone Zellkulturen
• 23.5.1 Zellseparation
• 23.5.2 Blockade des Zellzyklus
• 23.6 Zeitraffer-Mikrokinematographie
• 23.6.1 Videobandaufnahmen
• 23.6.2 Zeitraffer-Filmaufnahmen
• 23.7 Amniozentese
• 23.8 Fusion somatischer Zellen
• 23.8.1 Selektion von Hybridklonen
• 23.9 Gentransfer
• 23.10 Produktion monoklonaler Antikörper
• 23.11 Molekulare Hybridisierung in situ
• 23.12 Präparation und Nachweis von Viren
• 23.13 Schlußbetrachtung
• 24 Reagenzien
• 25 Zellkultur-Bedarfsartikel
• 25.1 Hersteller oder Lieferanten
• 25.2 Adressen
• 26 Glossar
• Literaturverzeichnis
• Register