Técnicas de análisis de imagen, (2a ed.)

Aplicaciones en Biología

José F. Pertusa Grau

• Publisher: Publicacions de la Universitat de València
• Year: 2015
• ISBN:
  9788437082882
• Topic: Biological Sciences
• Subtopic: Biology
• Index: Biological Sciences

Las técnicas de proceso y de análisis de la imagen digital resultan cada vez más imprescindibles para el estudio o el trabajo relacionado con la biología. Un libro fundamental, de carácter divulgativo, que permite incorporar al currículum de los estudiantes de Biología las materias necesarias para conocer las más recientes técnicas de análisis de la imagen digital.

1. La imagen

El hombre, como el resto de los primates, es un animal eminentemente visual. Este hecho ha sido esencial en el desarrollo de nuestra especie, porque nos ha llevado a que nos valgamos de la imagen como elemento primordial para relacionarnos con nuestro entorno. La imagen es un pilar fundamental en las relaciones con nuestros semejantes, de manera que la mayor parte de la información del mundo la recibimos por medio del sentido de la vista.

Hasta tal punto somos animales visuales que hemos llenado el lenguaje coloquial de expresiones referidas al uso de este sentido. Desde el clásico aforismo que dice que «una imagen vale más que mil palabras», hasta giros como «no lo veo claro» u otros como «¿lo ves?» o «se le ve venir», son alusiones metafóricas a la relación que encontramos entre la comprensión de una situación y la percepción visual.

Y si la imagen es esencial en la vida cotidiana, no digamos cuánto lo es en la investigación científica. También la ciencia apoya su trabajo en las imágenes y es posible que la biología, en especial, sea una de las materias que genere mayor cantidad de imágenes. La observación minuciosa y el análisis de estas imágenes son la base de la actividad científica que permite obtener información para plantear hipótesis y comprobarlas.

¿Cómo nos enfrentamos a la información visual? Toda imagen que percibimos es analizada por el cerebro de manera automática. El análisis aporta gran cantidad de información porque el cerebro, trabajando de forma comparativa, permite reconocer y clasificar objetos de muy diversa complejidad; reconocemos letras en un texto, la marca y el modelo de un coche o los rostros de otros miembros de nuestra especie. Este análisis nos da idea del aspecto, forma, textura, distancia, velocidad relativa, tipo de movimiento y otras particularidades ligadas a los objetos contenidos en las imágenes. Esta capacidad humana es, hoy por hoy, inalcanzable para cualquier máquina, ordenador o sistema informático, por muy complejo que sea. Ninguna máquina tiene la capacidad del cerebro humano para clasificar objetos; ni siquiera muchos otros animales son capaces de competir con el sistema binario humano ojo-cerebro, ya que aquellos son incapaces de reconocer a sus propios congéneres.

La fantástica capacidad de clasificación de nuestro cerebro se basa, fundamentalmente, en la comparación de las imágenes. Nuestro análisis es cualitativo y casi inmediato. Si en una reunión de amigos alguien nos presenta a otra persona, inmediatamente sabemos, mirando únicamente su cara, si se trata de un hombre o una mujer; somos capaces de clasificar rápidamente el sexo de nuestros congéneres (muy pocas veces erramos) comparando el nuevo rostro con los rostros de nuestros conocidos, y extrayendo de inmediato el estereotipo «sexo al que pertenece». Los detalles comparativos en los que basamos nuestra clasificación son muy sutiles y vagos, pero lo suficientemente claros para proporcionarnos un altísimo índice de certeza, excepto en ciertas situaciones en las que el patrón se hace difícil de aplicar y se nos plantean serias dudas ante un rostro indefinido como el de un niño.

Ahora bien, el cerebro humano no es muy bueno cuando se trata de realizar un análisis cuantitativo de la imagen. Si se nos presenta un grupo de personas de pie, no tendremos demasiados problemas en ordenarlos por altura, pero tendremos ciertas dificultades para calcular la altura de uno en particular, incluso teniendo delante una referencia de longitud. Sin embargo este tipo de cuantificaciones es muy corriente en la tarea científica básica y es aquí donde los ordenadores pueden ser de mucha utilidad, en especial cuando se precisa automatizar una tarea de cuantificación para hacerla repetitiva. Y, simplemente, en eso consiste el análisis de imagen.

Ciertamente, un equipo de análisis de imagen puede identificar y clasificar objetos, pero el procedimiento que utiliza en esta operación es, precisamente, el opuesto al que utiliza nuestro cerebro: mientras que el cerebro clasifica sin medir, por comparación del problema actual con los datos acumulados con ante-rioridad, el equipo de análisis de imagen mide primero, obtiene datos numéricos de la morfología (área, perímetro, longitud, anchura) y las características ópticas (color, densidad óptica) y, en función de esos parámetros, clasifica los objetos.

1.1 Análisis de imagen y procesado de imagen

El término «análisis de imagen» hace referencia al estudio realizado sobre la imagen con el fin de obtener información de ella. En principio, no se trata de obtener específicamente datos cuantitativos o cualitativos. Pero, dado que para nosotros es más complicado apreciar las dimensiones de las cosas y que nos es más costoso medir un objeto que recordar su forma, el tiempo ha ido relacionando casi unívocamente el término «análisis de imagen» con la obtención de información cuantitativa.

Así pues, se podría definir nuevamente el término de análisis de imagen como un «proceso» mediante el cual se extrae información cuantitativa de la imagen. Por otra parte, esta definición no implica que el proceso deba realizarse de una manera especial; simplemente se extrae información cuantitativa de la imagen. La obtención manual de un dato a partir de una fotografía utilizando una regla o un pie de rey también es un análisis de imagen. Sin embargo, tal y como hoy en día es entendido, el análisis de imagen es un proceso llevado a cabo por un sistema informático, capaz de extraer de forma casi instantánea toda la información relevante contenida en una imagen determinada.

Deberíamos hacer una matización ahora que hemos introducido el ordenador digital como herramienta primordial en análisis de imagen porque se tiende a confundir el concepto de análisis de imagen con el de procesado de la imagen. La diferencia queda bien patente en la definición apuntada más arriba: un analizador de imagen siempre cuantifica y, por lo tanto, el resultado del análisis de imagen siempre es una tabla de datos, una gráfica o cualquier representación de los datos numéricos. El procesado de imágenes, sin embargo, siempre produce otra imagen como resultado de la operación; en este caso se pretende, por lo general, mejorar la calidad de una imagen para facilitar la observación de determinados detalles. Un sencillo ejemplo de procesado de imagen que solemos ver con cierta indiferencia es el de los mapas meteorológicos de temperaturas, en los que se colorean los mapas con diversos tonos cálidos (en la gama de los rojos) o fríos (en la de los azules) para facilitar la observación del espectador. Dentro del trabajo científico también se utiliza este sencillo sistema para destacar elementos de la imagen; así, es frecuente encontrar coloraciones con falso color en gamas cálidas o frías para destacar actividad cerebral o regionalización de estructuras en imágenes radiográficas; incluso se utiliza con éxito en la divulgación científica, para hacer más bonitas las imágenes obtenidas por el microscopio electrónico que, como todo el mundo sabe, se obtienen en el más absoluto blanco y negro. La razón de este maquillaje colorista se encuentra en que el ojo humano aprecia mucho mejor los contrastes cromáticos que las diferencias de tonos grises, tal y como lo atestigua la anatomía de la retina dotada de conos y bastones.

El procesado de imágenes puede ser útil, imprescindible en ocasiones, como un paso previo al análisis de la imagen. De hecho, mediante esta técnica se pueden destacar aquellos detalles de la imagen que se quieren medir, o eliminar aquellos otros que dificulten o enmascaren los elementos más esenciales. Es obvio que cualquier modificación de la imagen puede suponer la alteración de la información allí contenida y, por ello, cuando el procesado es un paso previo al análisis, debemos valorar si las modificaciones que se puedan producir en la imagen afectan a los parámetros de nuestro interés.

Un ejemplo biológico que puede resumir lo expuesto hasta el momento es el análisis cariotípico de un individuo cualquiera (fig. 1.1). El proceso comienza con la paralización de las células en la metafase de la mitosis, lo que normalmente se consigue con la adición de un veneno de los microtúbulos como la colchicina que impide que prosiga el reparto cromosómico. A continuación se deposita la célula sobre un portaobjetos, procurando que se rompa la membrana celular para que los cromosomas queden separados y extendidos sobre el portaobjetos. Se colorean los cromosomas y, por último, se obtiene una imagen, supongamos, fotográfica. Ahora ya tenemos posibilidad de analizar una imagen. Y ¿qué buscamos analizar? Pues el número y tamaño relativo de los cromosomas. Para ello los colocaremos ordenadamente en función de sus longitudes y de la posición relativa de su centrómero, y construiremos el idiograma.

Fig. 1.1 Cromosomas de ratón. Imagen en negativo (izq.) y positivo (der.).

El positivado en papel a partir del negativo fotográfico (que es, en realidad, la imagen captada más próxima a la original) ya es un procesado de imagen que consiste en la conversión de las partes negras de la imagen en blancas y viceversa. Este procesado tiene como único objetivo que tengamos una representación visual de los cromosomas lo más semejante posible a como los vemos a través del microscopio.

Si comenzamos nuestro análisis de imagen por el recuento de cromosomas, enseguida obtendremos el dato numérico. Es un análisis de imagen sencillo pero un análisis al fin y al cabo; incluso si algún cromosoma ha caído superpuesto a otro y sus brazos se cruzan, nuestra pericia técnica nos permite detectar que son dos elementos distintos y anotar dos marcas en vez de una. Pero si pretendemos ordenar los cromosomas por tamaño, deberemos medir sus longitudes y, conocidas sus longitudes, recortarlos y pegarlos en el orden correcto. Dejando por el momento el problema del cálculo de la longitud de un cromosoma, para separar dos de ellos que hayan caído cruzados en la muestra, deberemos hacer dos copias de la imagen para que podamos recortar en cada copia uno de los cromosomas. Una vez recortados los cromosomas se pegan en una lámina, ya ordenados y… ¡por fin!, ¡Idiograma conseguido! Pues bien, todas las manipulaciones y copias de la foto, los recortes y composición de los cromosomas, no son sino procesos sobre la imagen. El auténtico análisis, por ahora aplazado, es el cálculo de las dimensiones de los cromosomas, que es justamente lo que nos permite la correcta ordenación por tamaños.

No siempre se precisa del procesado de la imagen para realizar el análisis de imagen. El recuento de eritrocitos con una cámara cuentaglóbulos es uno de esos casos. La técnica preparatoria asegura que el recuento se pueda llevar a cabo con solo cargar la cámara de recuento; entonces el experimentador puede comprobar que unos discos refringentes, los eritrocitos, se encuentran esparcidos sobre una rejilla cuadriculada. El análisis acaba cuando obtenemos el número de eritrocitos contenidos en un número de cuadrículas determinado, esto es, en un área de referencia.

1.2 Tipos de imagen con interés biológico

Las imágenes biológicas se generan por interacción de las ondas electro-magnéticas con los objetos biológicos. En realidad todas las imágenes cotidianas del mundo que nos rodea se generan de forma semejante, aunque nuestra apreciación de lo cotidiano a veces no nos permite percatarnos de manera consciente del mecanismo por el que un objeto se hace visible a nuestros ojos. Pero como el presente manual va dirigido especialmente a los estudiantes del área de biología, nos vamos a centrar en las imágenes que con mayor frecuencia se manejan en esta disciplina.

1.2.1 Ondas electromagnéticas transmitidas

Se trata del sistema que utiliza la microscopía de transmisión. Una fuente de ondas electromagnéticas, que suele ser una bombilla en el caso de la microscopía óptica y un filamento incandescente en la microscopía electrónica (aunque en este caso la luz es un haz de electrones), genera un rayo que atraviesa la muestra biológica que se encuentra interpuesta en su camino. En la interacción de la luz con el espécimen se produce la absorción, reflexión y refracción de la luz al atravesar las distintas estructuras que componen el material biológico, con lo que la luz se desvía de su recorrido y se produce una imagen con regiones de luces y sombras.

El fenómeno de interferencia se puede incrementar con la adición de colorantes o contrastantes, según sea el caso, con distinta afinidad por los elementos de la muestra; entonces se produce la absorción de determinadas bandas del espectro de luz y de esa manera se pueden observar, en microscopía óptica, partes con diversas coloraciones que hacen más evidentes y más contrastadas las diferentes porciones de la muestra. La aplicación de contrastantes en micros-copía electrónica de transmisión hace que algunos elementos de la muestra se mantengan permeables a los electrones, mientras que otros se hagan opacos a los mismos, con lo que se produce igualmente el incremento de contraste entre los orgánulos celulares. La imagen que se genera está compuesta por zonas más o menos claras, según la concentración de los colorantes o la presencia de sustancias opacas a los electrones. Nótese que las imágenes de microscopía óptica están dotadas de color, mientras que las procedentes de microscopía electrónica son imágenes monoespectrales.

En todos los casos la característica común es que la dirección del haz de luz y la posición de la muestra forman un ángulo de 90 grados. Los fenómenos de reflexión no intervienen de manera importante en la formación de este tipo de imágenes, con excepción de ciertos casos, por lo que la imagen rara vez nos produce sensación de profundidad: se trata de imágenes, literalmente, planas.

Fig. 1.2 Epitelio de la cara inferior de la lengua del ratón. Micros-copía óptica de luz transmitida.

Fig. 1.3 Células hematopoyéticas de la dorada (Sparus aurata). Microscopía electrónica de transmisión. (Imagen cedida por el Dr. J. Meseguer. Departamento de ...