Konfokale Einzelpartikel-Detektion von fluoreszenz-kodierten Nanospheres.

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• Publisher: Cuvillier Verlag
• Year: 2008
• Print ISBN: 9783867276061
• eBook ISBN: 9783736926066
• Edition: 0

Ziel dieser Arbeit war es, einzelne fluoreszenz-kodierte Nanopartikel von derGröße 20-40 nm bei diffusiven Durchgängen durch ein konfokales Fokalvolumenmit einem Radius von 200-300 nm identifizieren und charakterisieren zu können.Hintergrund hierbei ist, dass durch die Kodierung eine große Anzahlverschiedener Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen in kurzer Zeit in einemeinzelnen parallelen Reaktionsansatz untersucht werden kann, wasinsbesondere bei Massendurchsatzverfahren, wie z.B. der DNA-Analyse oderder Analyse von Glycokonjugaten, von Vorteil ist. Zunächst wurde hierzu einekonfokale Mikroskopapparatur mit einer gepulsten Ti: Sa-Laserquelle zur Zweiphotonen-Anregung aufgebaut und detektionsseitig die emittierte Fluoreszenzin drei spektralen Regionen separat aufgezeichnet. Die aus den Messungen erhaltenenDaten wurden dann mit einer selbst programmierten Software ausgewertet.Für die parallelisierten Messungenmussten effektive Identifikationsalgorithmen programmiert, evaluiert und getestetwerden. Hierzu war es erforderlich, zur Differenzierung geeignete Charakteristikader auftretenden Photonenbursts zu finden und die zur Verfügung stehendenNanopartikel diesbezüglich zu analysieren. Aus den Absorptions- und Emissionsspektrender Partikel zeigte sich bei den mehrfach gefärbten Typen, dass insbesondere bei der Zweiphotonen-Anregung effektiv nur das am langwelligsten emittierende Fluorophor Photonen abgibt. Es stellte sich heraus, dass hierfür effektive Förster-Resonanz-Energietransfer-Prozesse (FRET) verantwortlich sind, die durch große Spektralüberlappungen und kleinen Fluorophorabständen in den Partikeln begünstigt werden. Dadurch, dass die Unterscheidung mehrfach angefärbter Partikeltypen anhand ihrer Fluoreszenzemissionen durch FRET-Prozesse erschwert ist, wurde zunächst die parallele Unterscheidung einfach angefärbter Typen untersucht. Fürdiese Typen wurden dann über multiple Messungen typenreiner ProbenFilterverteilungen der Identifikationsparameter aufgenommen und abgeschätzt, inwiefern die Identifikationsalgorithmen in der Lage sein sollten, sie zuunterscheiden. Um Einflüsse von Burstüberlappungen und peripheren Passagenzu quantifizieren, wurde eine Simulation programmiert und die verschiedenenAlgorithmen auf die resultierenden Zeitspuren angewendet. Die Effizienz verschiedener Algorithmen die einzelnen Typen zu differenzieren, wurde dann zunächst an fünf Einpartikelsystemen getestet wobei eine nahezuhundertprozentige Identifikation erreicht wurde. Die Anwendung der Algorithmenauf alle möglichen Permutationen an Mehrkomponentensystemen zeigteteilweise geringfügig höhere Fehlerraten als bei den Einkomponentensystemen, allerdings konnten einzelne Nanopartikel immer noch mit einer Sicherheit vonmehr als 95 % identifiziert werden. Bei der Analyse von einzelnen Fluoreszenzburstskonnten weitere interessante Phänomene beobachtet werden. So zeigten Messungen der Fluoreszenzlebensdauer an Ensembles einiger Partikel und bei der Einzelburstfluoreszenzlebensdauer aller Partikel eine Abhängigkeit von der Anregungsleistung. Die Begründung liegt hierbei in der Zunahme äußerst effektiver zusätzlicher FRETWege angeregter Zustände. Darüber hinaus wurden Effekte auf dieFluoreszenzlebensdauer als Funktion der Partikelgröße beobachtet. DerVergleich von Partikeln verschiedener Größe zeigte eine Reduzierung derLebensdauer mit zunehmender Partikelgröße, was durch die Veränderung derPopulationsverhältnisse zugunsten der schneller relaxierenden Fluorophore imKugelkern bedingt ist. Weitere Effekte auf die Komponenten derFluoreszenzabklingdynamiken konnten durch veränderte Geometrie undmultiplen Homoenergietransfer erklärt werden. Bei der Autokorrelationsanalyse zeigte sich eine stark typenspezifische Abhängigkeit des Fokalvolumens von der Laserleistung, die proportional zur jeweiligen Anregbarkeit der Partikel war.Zusammenfassend ist es gelungen, extrem effiziente Identifikationsalgorithmenfür diffusive Durchgänge einzelner Nanopartikel zu entwickeln.Zukünftige Arbeiten werden sich mit der selektiven Bestückung der verschiedenen Partikel mitunterschiedlichen Liganden und parallelisierten Messungen ihrer Interaktionen mit Zielmolekülen, wie z.B. Lektinen, befassen. In einer in ChemBioChem [12] veröffentlichten Arbeit, konnte unsere Arbeitsgruppe bereits zeigen, dass die Belegung von einfach gefärbten Nanopartikeln mit unterschiedlichen Oligosacchariden die Messung von relativen Lektin- Bindungsaffinitäten erlaubt. Diese Messungenlassen sich mit dem in dieser Arbeit entwickelten Verfahren nun auf die simultane Messung von Affinitäten und Kreuzaffinitäten ganzer Oligosaccharid-Bibliotheken erweitern. Die durch FRETProzesse verursachte Differenzierungsproblematik bei mehrfach angefärbtenNanopartikeln wird sich in zukünftigen Entwicklungen durch selektive Anregungder unterschiedlichen Absorptionsbanden, die auch als Kodierungsmerkmalverwendet werden können, umgehen lassen.

Table of contents

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