Heteromultimerisierung und Stöchiometrie heterotrimerer P2X-Rezeptoren

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• Publisher: Cuvillier Verlag
• Year: 2009
• Print ISBN: 9783867278799
• eBook ISBN: 9783736928794
• Edition: 1

P2X-Rezeptoren sind eine Familie von liganden-gesteuerten Kationenkanälen, welche sichbei Bindung von extrazellulärem ATP öffnen. Die sieben Isoformen (P2X1-P2X7) teilen einegemeinsame Topologie mit zwei Transmembranregionen, einer großen extrazellulärenSchleife und intrazellulären N- und C-Termini. Die Ektodomäne ist N-glykosyliert und weistfünf konservierte Disulfidbrücken auf. Mit der Ausnahme der P2X6-Isoform können sich dreiUntereinheiten einer Isoform zu einem funktionellen homotrimeren Rezeptorzusammenlagern. Durch Kombination verschiedener P2X-Isoformen können sich funktionelleheterotrimere P2X-Rezeptoren ausbilden, u.a. auch mit der P2X6-Untereinheit. Homomereund heteromere P2X-Rezeptoren finden sich im gesamten Organismus sowohl in neuronalenals auch in nicht neuronalen Zellen. Dabei reichen ihre physiologischen Funktionen von derschnellen synaptischen Transmission im zentralen, peripheren und enterischen Nervensystembis hin zur Freisetzung proinflammatorischer Zytokine aus Immunzellen.Ein erstes Ziel dieser Arbeit war die Überexpression des Ratten-P2X1-Rezeptors in dermethylotrophen Hefe Pichia pastoris und anschließende Reinigung für strukturelle Analysen.Anhand eines P.pastoris-Klons, welcher die rP2X1-Untereinheit stabil exprimierte, wurdendie Expressions- und Solubilisationsbedingungen für die rP2X1-Untereinheit auf maximaleAusbeute hin optimiert. Eine Induktionsdauer von 48 h bei 28°C und Einsatz von n-Dodecyl-ß-D-Maltosid als Detergenz zur Solubilisierung und Aufreinigung erwiesen sich als optimal.Deglykosylierungen ergaben, dass in P.pastoris exprimierte rP2X1-Untereinheiten nur drei NGlykaneaufweisen anstelle von vier N-Glykanen, die bei Expression in X.laevis-Oozytengefunden werden. BN-PAGE-Analyse ergab, dass in P.pastoris exprimierte rP2X1-Untereinheiten fast vollständig zu Aggregaten misassemblieren. Bei limitierter Trypsinolysewurde in P.pastoris exprimiertes rP2X1-Protein bei relativ niedrigen Trypsin-Konzentrationenweitgehend proteolysiert, was auf eine Fehlfaltung des rP2X1-Proteins hinweist. DieseFehlfaltung ist vermutlich ursächlich für die Missassemblierung zu rP2X1-Aggregaten. InX.laevis-Oozyten exprimiertes rP2X1-Protein zeigte im Gegensatz hierzu die bekannte trimereAssemblierung und eine relative Trypsin-Resistenz.Weiteres Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer nicht-radioaktivenMarkierungsmethode zur biochemischen Analyse der Oberflächenexpression vonMembranproteinen in X.laevis-Oozyten. Hierfür wurden in X.laevis-Oozyten exprimierteP2X-Rezeptoren mit dem reaktiven Fluoreszenzfarbstoff Cy5-NHS-Ester kovalent an derPlasmamembran markiert, gereinigt und nach SDS-PAGE mittels Typhoon-Fluoreszenz158Scanning im SDS-PAGE-Gel detektiert. Da der für die BN-PAGE erforderliche Coomassie-Farbstof die Cy5-Fluoreszenz vollständig auslöschte, wurde zur Sichtbarmachung Cy5-markierter Plasmamembran-ständiger P2X-Rezeptoren ein Entfärbeverfahren entwickelt, welches ein effizientes Herauslösen von Coomassie aus dem BN-PAGE-Gel nach dem Laufermöglichte. Auf diese Weise erwies sich die entwickelte Methode auch zur Darstellung derQuartärstruktur Plasmamembran-ständiger Proteine als geeignet.Durch Kombination der beschriebenen Fluoreszenzmarkierung mit Strep-Tactin-Affinitätschromatografie wurde die Möglichkeit geschaffen, das Heteromerisierungverhaltenvon P2X-Rezeptoren durch Koexpression unterschiedlicher P2X-Untereinheiten in X.laevis-Oozyten zu untersuchen. Neben bereits bekannten heteromeren P2X-Rezeptoren (rP2X1+2, rP2X1+4, rP2X1+5, rP2X1+6, rP2X2+3, rP2X2+5, rP2X2+6, rP2X4+5, rP2X4+6, rP2X3+5, rP2X5+6 undrP2X4+7) konnten erstmals die P2X-Heteromere rP2X2+4-, rP2X3+4-, rP2X3+6-, rP2X2+7-, undrP2X6+7-Rezeptoren identifiziert werden.Eingehendere Untersuchung des rP2X1+6-Heteromers mittels BN-PAGE-Analysezeigte dessen Assemblierung zu heterotrimeren Rezeptoren. Zusätzlich konnte gezeigtwerden, dass die Koassemblierung der rP2X6-Untereinheit mit anderen P2X-Untereinheitenzu einer faltungsbedingten Maskierung der N-Glykane der rP2X6-Untereinheit führt, so dasssie den Golgi-Apparat in core-glykosylierter Form passiert. Außerdem werden rP2X6-Untereinheiten im heterotrimeren Komplex effizienter an die Plasmamembran transportiert.Elektrophysiologische Untersuchungen deckten einen neuen Phänotyp für das P2X1+6-Heteromer auf, welches sich durch sein nicht-desensibilisierendes Verhalten eindeutig vomrasch desensibilisierenden P2X1-Rezeptor unterscheidet; homomer exprimierte P2X6-Untereinheit selbst bilden dagegen keinen funktionsfähigen Rezeptor aus.Um die Stöchiometrie der P2X-Untereinheiten in den heterotrimeren RezeptorenP2X1+2 und P2X2+3 zu bestimmen, wurden drei Verfahren eingesetzt: (i) Fluoreszenzdetektionselektiv mit Strep-Tactin-Chromatographie aufgereinigter, GFP-markierter P2X-Rezeptorenim BN-PAGE-Gel; (ii) Quantifizierung Cy5-markierter P2X-Untereinheit im heteromerenRezeptorkomplex; (iii) Einzel-Molekül-Spektroskopie zur Messung der Reduktion der CFPFluoreszenzlebensdauereines FRET-Paares aus heterotrimeren P2X1-CFP/P2X2-YFP oderP2X1-YFP/P2X2-CFP-Rezeptoren. Übereinstimmend ergab sich sowohl für das P2X1+2-Heteromer als auch das P2X2+3-Heteromer eine 2: 1 Stöchiometrie aus zwei P2X1- bzw. P2X3-Untereinheiten und jeweils einer P2X2-Untereinheit. Durch Koexpression von CFP- oderYFP-fusionierten P2X1- oder P2X2-Untereinheiten in HEK293-Zellen konnte derenKolokalisation in der Plasmamembran auch in Säugerzellen bestätigt werden.