Untersuchung der Strukturdynamik einzelner Proteine bei tiefen Temperaturen

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• Publisher: Cuvillier Verlag
• Year: 2011
• Print ISBN: 9783869556567
• eBook ISBN: 9783736936560
• Edition: 1

KurzbeschreibungIn dieser Arbeit wurde die Strukturdynamik einzelner Proteine bei tiefen Temperaturen untersucht. Dazu wurden Serien von Fluoreszenzanregungsspektren an einzelnen peripheren Lichtsammelkomplexen von Purpurbakterien bei tiefen Temperaturen aufgenommen. Aus diesen Serien von Spektren wurden Trajektorien der spektralen Diffusion einzelner, in der Proteinmatrix der Komplexe eingebetteter BChl a-Moleküle erhalten.Eine Kumulanten-Analyse dieser Trajektorien lieferte die Verteilungen der ersten beiden Kumulanten der optischen Anregungen. Die Verteilungen der ersten Kumulante waren in allen beobachteten Fällen gaußförmig oder durch gaußförmige Beiträge zusammengesetzt. Zur Interpretation dieser Beobachtung wurden zuerst die Vorhersagen des TLS-Standardmodells, durch welches die spektrale Diffusion in Gläsern erfolgreich beschrieben werden kann, für die ersten beiden Kumulanten hergeleitet. Durch den Vergleich der Vorhersagen mit den experimentell gewonnenen Verteilungen der ersten Kumulante konnte eindeutig gezeigt werden, dass eine gemeinsame Beschreibung der wesentlichen Eigenschaften spektraler Diffusion von Proteinen und Gläsern nicht zutreffend ist. Die Ergebnisse zeigen, dass die Konformationsänderungen von Proteinen bei tiefen Temperaturen nicht durch das TLS-Standardmodell beschrieben werden können. Jedoch war es durch die Analyse der Kumulanten-Verteilungen möglich, zwei Klassen von TLS-Verteilungen abzuleiten, welche die experimentellen Ergebnisse zufriedenstellend erklären.Bei der Anwendung des Konzepts des spektralen Diffusionskerns zur Beschreibung der experimentellen Ergebnisse konnte die Identität der Verteilung der ersten Kumulante mit dem spektralen Diffusionskern gezeigt werden. Damit wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals der spektrale Diffusionskern eines einzelnen, in ein Protein eingebetteten Farbstoffes, dargestellt.Durch Analyse der spektralen Diffusionskerne wurden die von den beiden TLSKlassen erzeugten spektralen Verstimmungen der BChl a-Moleküle ermittelt. Der Vergleich mit druckinduzierten Verstimmungen von in Proteine eingebetteten Farbstoffen erlaubte es, aus den TLS-induzierten spektralen Verschiebungen den Mindestabstand beider TLS-Klassen zum Farbstoff abzuschätzen. Ein Vergleich der Abstände mit der Kristallstruktur von Rps. acidophila ergab, dass TLS der Klasse mit geringen spektralen Verschiebungen wahrscheinlich außerhalb des Proteins angesiedelt sind. Sie wurden deshalb der Dynamik des Lösungsmittels bzw. der Protein-Lösungsmittel-Grenze zugeordnet. Die andere Klasse der TLS, welche zu starken Verstimmungen des Farbstoffes führt, liegt allerdings höchstwahrscheinlich im Protein oder sogar innerhalb der Bindungstasche des Farbstoffes. Durch die voneinander getrennt beobachtete Dynamik des Proteins und des Lösungsmittels wurde wahrscheinlich erstmalig der Prozess des slavings bei einzelnen Proteinen gezeigt.Sowohl die Elektron-Phonon-Kopplung einzelner B800 BChl a-Moleküle als auch die spektrale Diffusion wurde bei den drei Spezies Rb. sphaeroides, Rsp. molischianum und Rps. Acidophila verglichen. Obwohl alle untersuchten Anregungen eine schwache Elektron-Phonon-Kopplung aufwiesen, konnte ein signifikanter Unterschied der Verteilungen der Debye-Waller Faktoren von Rps. acidophila und Rsp. molischianum im Vergleich zu der Verteilung bei Rb. sphaeroides festgestellt werden. Dies wurde verglichen mit der spektralen Diffusion der drei Spezies. Gestützt auf diese Vergleiche und ein auf Rps. acidophila aufbauendes Homologiemodell konnte ein vorläufiges Modell der B800-Bindungstasche von Rb. sphaeroides vorgeschlagen werden.Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Einzelmolekülspektroskopie eine hervorragende Methode ist, um die Strukturdynamik von Proteinen bei tiefen Temperaturen zu untersuchen. Die Wechselwirkung von Farbstoffen mit ihrer individuellen Proteinumgebung führt zu spektralen Merkmalen, die durch die in Ensemblemessungen instrinsische Mittelung nicht beobachtet werden können. Durch den Zugang zu Verteilungen von Parametern anstelle von Mittelwerten werden wertvolle Beiträge zur Modellbildung der Strukturdynamik von Proteinen ermöglicht.DescriptionIn this thesis the structural dynamics of single proteins at low temperatures were investigated. Therefore, long series of fluorescence-excitation spectra of individual peripheral light-harvesting complexes were recorded. From these series of spectra, trajectories of the spectral diffusion of individual BChl a-molecules, embedded in the protein-matrix of the complexes were obtained.A cumulant-analysis of these trajectories revealed the distributions of the first two cumulants of the excitations. The line-shape of these cumulant-distributions was gaussian or consisted of gaussian contributions. Since the behaviour of a protein at low temperatures has often been likened to a glass, the predictions of the standard TLS-model for the first two cumulants of a chromophore embedded in a disordered matrix were derived. By comparing the predictions with the experimentally obtained distributions of the first cumulant, it was clearly shown that there is a fundamental difference between the relaxation behavior of our test protein and that of glasses and that the standard TLS-model does not provide a valid description of our experimental results. The results show that the conformational dynamics of proteins at low temperatures can not be described by the standard TLS-model. Nevertheless, by analyzing the cumulant distributions it was possible to derive two classes of TLS-distributions, which explained the experimental results satisfyingly.Applying the concept of the spectral diffusion kernel to the obtained cumulant distributions, it was possible to identify the first cumulant of a chromophore with its spectral diffusion kernel and so, for the first time reported, obtain the spectral diffusion kernel of a single protein.Further analysis of these spectral diffusion kernels lead to an estimation of the spectral shifts caused by these two classes of TLS. The comparison with pressureinduced spectral shifts of protein-embedded chromophores additionally allowed to estimate the minimum-distances of these TLS-classed to the chromophore. A comparison with the crystal structure of Rps. acidophila concluded, that the class which causes the minor sprectral shifts is located in the solvent or at the proteinsolven boundary. The class responsible for the large spectral changes located within the protein, possibly even within the binding-pocket of the investigated chromophore. By this seperated observation of protein-related and solvent-related dynamics its possible that for the first time a concept called slaving was recorded for a single protein.The electron-phonon coupling of single B800 BChl a-molecules and the spectral diffusion was finally compared for light-harvesting complexes of the three species Rb. sphaeroides, Rsp. Molischianum and Rps. acidophila. Although all Debye-Waller-factors indicated weak electron-phonon-coupling, clear differences in the distributions of the debye-waller-factors of Rps. acidophila and Rsp. molischianum compared to Rb. sphaeroides were found. This was compared with results from the spectral diffusion for all three species. From these comparisons and by using a homology-model based on the crystal structure of Rps. acidophila, a tentative model for the B800 binding pocket for Rb. sphaeroides was proposed.These results show that single-molecule spectroscopy is an outstanding tool to investigate the structure dynamics of proteins at low temperatures. The interaction of chromophores with their local protein environment leads to spectral features that usually are averaged in ensemble experiments. The access to distributions of parameters instead of mean values allows valuable contributions to model the structure dynamics of proteins.

Table of contents

• Veröffentlichungen
• Inhaltsverzeichnis
• Kapitel 1 Einleitung
• Kapitel 2 Spektroskopie einzelner Farbstoffe in amorphen Umgebungen
• Kapitel 3 Der photosynthetische Apparat von Purpurbakterien
• Kapitel 4 Experimentelles
• Kapitel 5 Tieftemperaturmodell von Proteinen
• Kapitel 6 Spektraler Diffusionskern und hierarchische Struktur einzelner Proteine
• Kapitel 7 Spektrale Diffusion und Linienformen in verschiedenen Proteinen
• Kapitel 8 Zusammenfassung
• Literaturverzeichnis
• Abstract
• Kurzfassung
• Danksagung