Reinigung und Charakterisierung von mTMEM16A und der C-terminalen Endodomäne des hP2X7-Rezeptors für die 2D-Kristallisation

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• Publisher: Cuvillier Verlag
• Year: 2011
• Print ISBN: 9783869559322
• eBook ISBN: 9783736939325
• Edition: 1

Strukturelle Charakterisierung der C-terminalen Endodomäne des hP2X7-RezeptorsDer P2X7-Rezeptor (P2X7R) gehört zur P2X-Rezeptorfamilie ATP-gesteuerterKationenkanäle. Die sieben Isoformen (P2X1-P2X7) teilen eine gemeinsame Topologie mitzwei Transmembranregionen, einer großen extrazellulären Schleife und intrazellulären N- undC-terminalen Domänen. Drei Untereinheiten einer Isoform assemblieren zu einemfunktionellen homotrimeren Rezeptor. Aufgrund seiner Lokalisation in Zellen mit Beteiligungan Schmerzentstehung, Entzündungsprozessen und neurodegenerativen Erkrankungen ist derP2X7R ein interessanter Angriffspunkt für die Entwicklungen neuer Arzneimittel gegenverschiedene Krankheiten. Strukturell unterscheidet sich die 595 Aminosäuren umfassendeP2X7R-Untereinheit von anderen P2XR-Subtypen (P2X1R-P2X6R) durch eine um 120-200Aminosäuren längere C-terminale Endodomäne. Funktionelle und biochemische Daten, dievon unserer Arbeitsgruppe zusammen mit der Arbeitsgruppe von Prof. Markwardt in Hallepubliziert wurden (Becker et al., 2008), lassen den Schluss zu, dass die C-terminaleEndodomäne des P2X7-Rezeptors ein Gating-Modul darstellt, wobei eine trimere Anordnungdes Moduls zur trimeren Struktur der P2X7-Rezeptoren passen würde. Modelle, wie solchecytoplasmatische Domänen das Öffnen von Ionenkanälen regulieren, wurden bereits fürspannungsabhängige K+-Kanäle durch Kombination funktioneller Daten mit Kristallographie-Strukturdaten abgeleitet. Die C-terminale Endodomäne des hP2X7-Rezeptors (hP2X7355-595-Protein) wurde in dieser Arbeit in der methylotrophen Hefe P. pastoris überexprimiert unddurch Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Nach Optimierung derAufreinigungsbedingungen konnte ~1, 5 mg hP2X7355-595-Protein in hoher Reinheit pro LiterKulturmedium aufgereinigt werden. 2D-Kristallisationsversuche mit demHis-hP2X7355-595-Protein wurden in Kooperation mit Prof. Schmidt-Krey an der Fakultät fürBiologie am Georgia Institute of Technology in Atlanta im Rahmen eines einjährigenAufenthalts durchgeführt. Durch die Optimierung der Kristallisationsparameter Lipid-Protein-Verhältnis (LPR), Salz sowie Temperatur wurde die Ausbildung von DMPC-Membranstrukturen günstig beeinflusst und eine Abnahme von zuvor vorhandenenProteinaggregaten beobachtet. Nach elektronenmikroskopischer Auswertung der Probenzeigte sich, dass es durch DMPC-Zugabe, in einem Lipid-Protein-Verhältnis von 1 bis 5, zueiner Stabilisierung des His-hP2X7355-595-Proteins kommt. Durch Zugabe von NaCl zumDialysepuffer konnte die Ausbildung von DMPC-Membranen gefördert werden. EineRekonstitution des His-hP2X7355-595-Proteins in die DMPC-Doppelschicht und eineAusbildung von kristallinen Bereichen konnte allerdings mit keiner derParameterveränderungen mit Sicherheit beobachtet werden. Die Optimierung weitererKristallisationsparameter ist daher Gegenstand aktueller Untersuchungen.Expression und Reinigung von TMEM16A für 2D-KristallisationsexperimenteDie TMEM16A/Anoctamin-Kanäle konnten 2008 unabhängig von drei Arbeitsgruppen alslang gesuchte Ca2+-aktivierte Chloridkanäle identifiziert werden. In unserer Arbeitsgruppekonnte mittels BN-PAGE-Analyse und Crosslinking-Experimenten erstmals gezeigt werden, dass das in X. laevis-Oozyten und HEK293-Zellen exprimierte TMEM16A-Protein stabil zuHomodimeren oligomerisiert und in homodimerer Form auch in der Plasmamembran dieserZellen vorliegt (Fallah et al., 2010, Molecular & Cellular Proteomics, ). Ziel der fortführendenArbeit war es, das TMEM16A-Protein in Milligramm-Mengen zu exprimieren und zureinigen, um es für strukturelle Untersuchungen mittels der 2D-Kristallisation verfügbar zumachen. Eine wichtige Frage war die Identifizierung von Detergenzien, die TMEM16Aschonend solubilisieren und gleichzeitig für die Kristallisation geeignet sind. Durch einumfassendes Screening konnte das nicht-ionische Detergenz C8E4 sowie dasDetergenziengemisch CHAPS und Triton X-100 als Detergenzien identifiziert werden, indenen sich TMEM16A als stabiles Homodimer verhält. In anderen untersuchten nicht-ionischer und zwitterionischen Detergenzien lag TMEM16A im nicht-denaturiertem Zustandin unterschiedlichen prozentualen Verhältnissen als Monomer und Dimer vor. DurchKultivierung in einem Spinner-System im Litermaßstab und affinitätschromatografischerAufreinigung gelang es, rekombinantes TMEM16A im Milligramm-Mengen in einer Qualitätzu isolieren, wie sie für die 2D-Kristallisation benötigt wird. Als weiteres Expressionssystemneben HEK293-Zellen erwiesen sich Sf158-Insektenzellen als geeignet, Milligramm-Mengenan homodimeren TMEM16A-Protein zu produzieren. Im Vergleich zu den in HEK293-Zellenexprimierten TMEM16A wies das Protein in Insektenzellen ein anderesGlykosylierungsmuster auf. Erste 2D-Kristallisationsexperimente mit dem aufgereinigtenTMEM16A werden zurzeit im Labor von Prof. Schmidt-Krey am Georgia Institute ofTechnology durchgeführt.

Table of contents

• Inhaltsverzeichnis
• Einleitung
• Zielsetzung der Arbeit
• Material und Methoden
• Ergebnisse
• Diskussion
• Zusammenfassung
• Literaturverzeichnis
• Anhang