Hygienisch-mikrobiologische Wasseruntersuchung in der Praxis

Nachweismethoden, Bewertungskriterien, Qualitätssicherung, Normen

Irmgard Feuerpfeil, Konrad Botzenhart

• Verlag: Wiley-VCH
• Jahr: 2012
• ISBN drucken: 9783527315697
• eBook-ISBN: 9783527660131
• Auflage: 1
• Thema: Physical Sciences
• Thema: Organic Chemistry

Alle g ngigen mikrobiologischen Nachweismethoden sind hier f r den Praktiker zusammengestellt. Sie werden mit Hilfe von Flu diagrammen und Referenzergebnissen leicht nachvollziehbar erkl rt. Zu jedem Nachweis werden die gesetzlichen Anforderungen und Bewertungsma st be erl utert - sowohl auf nationaler wie auf EU-Ebene. Damit ist das Werk eine sinnvolle Erg nzung der DEV-Loseblattsammlung. Unverzichtbar f r alle, die Wasseruntersuchungen in Auftrag geben, durchf hren oder bewerten wollen.

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Allgemeines

Konrad Botzenhart und Irmgard Feuerpfeil

Zum Schutz der menschlichen Gesundheit kommt der Sicherung der Trinkwasserversorgung eine hohe Bedeutung zu. Krankheitserreger können über das Trinkwasser wie durch kein anderes Medium in großen Teilen der Bevölkerung verteilt werden. Durch die Schaffung großer, zentraler Wasserversorgungen können gleichzeitig viele Menschen erkranken, wenn ein mit Krankheitserregern belastetes Trinkwasser verteilt wird. Um derartige Gesundheitsgefährdungen auszuschließen, sind strenge Anforderungen an das Trinkwasser festgelegt.

Bereits am 16. Juni 1906 veröffentlichte das Kaiserliche Gesundheitsamt die „Anleitung für die Errichtung, den Bau und die Überwachung öffentlicher Wasserversorgungsanlagen, welche nicht ausschließlich technischen Zwecken dienen“. Damit wurde vor 100 Jahren ein Ordnungsrahmen für die Trinkwasserhygiene in Deutschland geschaffen, der nicht an Aktualität eingebüßt hat. In der dazu entwickelten Strategie spielten bereits die bakteriologische Untersuchung des Trinkwassers und das Indikatorprinzip eine hervorragende Rolle.

Das Erkennen der Zusammenhänge zwischen Seuchenausbrüchen und Wasserqualität war eng verbunden mit der Entwicklung der bakteriologischen Untersuchungsverfahren für Trinkwasser.

Neuere Entwicklungen seit Bekanntmachung der EG-Richtlinie zur „Qualität des Wassers für den menschlichen Gebrauch“ (98/83/EG, 1998) wurden in der TrinkwV 2001 in nationales Recht umgesetzt.

Mit der Bezeichnung „Wasser für den menschlichen Gebrauch“ wurde durch die EG-Richtlinie und die TrinkwV 2001 der Geltungsbereich dahingehend erweitert, dass nicht nur das Wasser zum Trinken hohen Anforderungen im hygienischen Sinn gerecht werden muss, sondern die gleichen Anforderungen an das Wasser zur Körperreinigung, zur Zubereitung von Speisen und zum Wäschewaschen eingehalten werden müssen.

Um in der EG und auch in Deutschland vergleichbare Untersuchungsergebnisse zu erhalten, wurden in der EG-Richtlinie und in der TrinkwV 2001 für die mikrobiologischen Parameter die Untersuchungsverfahren, die Untersuchungsvolumina, die Untersuchungshäufigkeit und die Stelle der Einhaltung der Parameterwerte verbindlich vorgeschrieben.

Die Untersuchungsverfahren sind in den meisten Fällen genormt. Die in den letzten Jahrzehnten zur Untersuchung der Trink- und Badewasserproben eingesetzten Verfahren waren sog. „presence-absence“ Tests und wiesen die Mikroorganismen nur qualitativ nach. Die neuen Anforderungen an die Überwachung mit konzentrationsabhängiger Bewertung erfordern Untersuchungsverfahren, die eine quantitative Bestimmung der Parameter ermöglichen.

Durch die Einführung generell neuer Referenzmethoden zum Nachweis der mikrobiologischen Überwachungsparameter gibt es auch in dieser Hinsicht für Deutschland Neuerungen.

Im Falle der Bestimmung von E. coli werden z. B. durch Änderung des Nachweisprinzips jetzt auch anaerogene E. coli mit erfasst.

Das neue Nachweisverfahren für Enterokokken grenzt die nach TrinkwV 1990 bestimmte physiologische Gruppe der Fäkalstreptokokken auf den Nachweis von 4 typisch „fäkalen“ Enterokokkenarten ein.

Ebenso wird mit der Bestimmung von C. perfringens der „fäkale“ Vertreter der Clostridien anstatt der physiologischen Gruppe „sulfitreduzierende sporenbildende Anaerobier“ erfasst.

Neu ist auch, dass nach

15 Abs. 1 TrinkwV 2001 die Anwendung anderer, alternativer Methoden ermöglicht wird, sofern sie gleichwertige Ergebnisse zum Referenzverfahren (nach DIN EN ISO 17994) liefern.

Die Entwicklung führt neuerdings zu Methoden, mit denen typische Enzymwirkungen durch chromogene oder fluorogene Substrate nachgewiesen werden.

Die Trinkwasserinstallation von öffentlichen Gebäuden wurde verstärkt in die Überwachung der Trinkwasserqualität einbezogen, um neu erkannte Gefährdungen durch Biofilme und Wiederverkeimungen nach der Verteilung des Trinkwassers unter den Bedingungen der Hausinstallation erkennen und wirkungsvoll bekämpfen zu können. Hier kommt der Trinkwasserinstallation in medizinischen Einrichtungen, wie Krankenhäusern und Pflegeheimen, insbesondere Kontaminationen mit Legionellen und P. aeruginosa, besondere Bedeutung zu. Diese nicht fäkal bedingten Krankheitserreger werden durch das Indikatorprinzip nicht erfasst und müssen innerhalb der Überwachung direkt untersucht werden. Im Falle der Legionellen wurde erstmals die direkte Bestimmung eines Krankheitserregers in der TrinkwV 2001 gefordert. Legionellen und P. aeruginosa sind aber auch in die Überwachung von nach DIN 19643 betriebenen Beckenbädern einbezogen worden.

Im Falle weiterer Krankheitserreger, wie wasserübertragbarer Viren oder Parasitendauerformen, ist eine sog. „Endproduktkontrolle“ des Trinkwassers zur Überwachung aus methodischen Gründen nicht sinnvoll, zu aufwendig und zu kostenintensiv.

Hier sollten zur Risikoabschätzung vor möglichen Kontaminationen des Trinkwassers sog. „water safety plans“, die durch die WHO vorgeschlagen wurden, eingesetzt werden.

Die „Endproduktkontrolle“ des Trinkwassers wird hier ersetzt bzw. ergänzt durch die „Prozesskontrolle“ mit Ermittlung der Rohwasserbelastung durch sog. Indexpathogene (z. B. Campylobacter) und Bestimmung der Reduktionsraten durch die Trinkwasseraufbereitungsverfahren mittels Indikatoren.

Auch für die Badegewässer gibt es seit 2006 eine neue EG-Richtlinie (2006/7/EG, 2006), deren Vorgaben in deutsches Recht umgesetzt werden müssen. Hier sind ebenfalls wesentliche Neuerungen zu beachten, die auf den verbesserten Gesundheitsschutz der Badenden gerichtet sind. Unter anderem werden ebenfalls neue mikrobiologische Überwachungsparameter und Nachweisverfahren vorgegeben.

Die mikrobiologischen Untersuchungen zur Überwachung der Trink- und Badewasserqualität erfordern von den Untersuchungsstellen auch die Einhaltung neuer Qualitätskriterien – sie müssen eine Akkreditierung nachweisen. Damit soll sichergestellt werden, dass die Labore mit hoher Zuverlässigkeit und Sachkenntnis die Untersuchung der Wasserproben, einschließlich der Probenahme, nach den vorgeschriebenen Nachweisverfahren und Normen durchführen.

Die fachlich kompetente Untersuchung der Wasserproben, die Befundinterpretation durch den Amtsarzt oder in speziellen Fällen gemeinsam mit einem dafür geeigneten Hygieneinstitut stellen sicher, dass den Verbrauchern ein den Anforderungen der TrinkwV 2001 und weiterer technischer Regeln entsprechendes Trinkwasser zur Verfügung gestellt werden kann. Dies gilt in gleichem Maße für die Qualität des Badewassers.

Zu Fragen der hygienisch-mikrobiologischen Untersuchung der Wasserproben und zur Befundbewertung sollen die Beiträge in diesem Buch Antworten und Unterstützung geben.

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Methodische Grundlagen

Benedikt Schaefer

Die gesetzlichen Rahmenbestimmungen zum Betrieb eines Labors für mikrobiologische Wasseruntersuchungen umfassen neben den Arbeitsschutzbestimmungen auch seuchenrechtliche Aspekte. Da bei der Anzucht von Mikroorganismen aus Umweltproben nicht ausgeschlossen werden kann, dass auch pathogene Erreger angereichert werden, sind die Bestimmungen des Infektionsschutzgesetztes (IfSG) zu beachten. Eine Ausnahme kann man für Laboratorien annehmen, in denen nur Koloniezahlbestimmungen, Untersuchungen auf das Vorkommen von E. coli und coliforme Keime und auf intestinale Enterokokken durchgeführt werden. Bei allen anderen Untersuchungen ist davon auszugehen, dass im Labor mit Krankheitserregern umgegangen werden muss, beispielsweise im Rahmen der Qualitätssicherung (Positivkontrollen, Ringversuchsproben). Die wichtigste Voraussetzung für den Umgang mit Krankheitserregern ist eine entsprechende Erlaubnis für den Laborleiter gemäß

44 Infektionsschutzgesetz (IfSG). Die geplante Aufnahme von Tätigkeiten mit Krankheitserregern ist gemäß

49 IfSG anzeigepflichtig.

Laboratorien, die Untersuchungen gemäß Trinkwasserverordnung (TrinkwV) durchführen, müssen gemäß

15 Abs. 4 von der zuständigen Behörde des jeweiligen Bundeslandes dafür zugelassen sein. Voraussetzung für die Zulassung ist eine Akkreditierung (s.a. Kapitel 3.1).

2.1 Reinigen und Sterilisieren der Labormaterialien

Benedikt Schaefer

Vor der Beschaffung von Labormaterialien ist die grundsätzliche Frage zu klären, ob Einwegmaterial oder wieder verwendbare Artikel verwendet werden sollen. Einwegmaterial ist in der Regel gebrauchsfertig und wird nach Gebrauch entsorgt. Das führt zu großen Mengen Müll. Die Kosten für die Müllentsorgung müssen bei der Wirtschaftlichkeitsbetrachtung berücksichtigt werden. Das Waschen der wieder verwendbaren Materialien erfordert den Einsatz von Arbeitszeit, Waschwasser und Reinigungsmitteln.

Petrischalen sind aus Kunststoff oder aus Glas. Glaspetrischalen werden vor Befüllen mit Nährboden durch Heißluft sterilisiert, Kunststoffpetrischalen genügen bei üblichen Verwendungszwecken ohne weitere Sterilisation den Anforderungen. Bei längeren Inkubationszeiten wie zum Beispiel bei der Untersuchung auf Legionellen sollte strahlensterilisierten Petrischalen der Vorzug gegeben werden.

2.1.1 Reinigung

Glasgeräte und wieder verwendbare Kunststoffartikel werden grundsätzlich vor jedem Gebrauch, auch vor dem Erstgebrauch, mit handelsüblichen Spülmitteln heiß gewaschen. Vorteilhaft ist die Verwendung von Laborglas-Waschautomaten mit den dazugehörigen Spezialwaschmitteln. Für die verschiedenartigen Glasgefäße und Geräte gibt es Wascheinsätze. Besonders für die Innenreinigung von engen Röhren wie Glaspipetten sind dafür konstruierte Wascheinsätze unverzichtbar. Bei manuellem Waschen ist unter Waschmittelzugabe ebenfalls heiß zu waschen. Hier empfiehlt sich mehrmaliges Nachspülen mit heißem Wasser. Wichtig für die Sauberkeit des Glases ist ein abschließendes Klarspülen mit Wasser von hoher Reinheit. Für mikrobiologische Untersuchungen reicht in der Regel das Spülen mit destilliertem Wasser oder vollentsalztem Wasser (VE-Wasser) aus.

2.1.2 Heißluftsterilisation

Nach dem Waschen wird das Glas im Trockenschrank getrocknet und anschließend in Heißluftsterilisatoren sterilisiert. Öffnungen bei Flaschen, Kolben u. ä. werden vor der Sterilisation mit Verschlüssen oder mit Aluminiumfolie abgedeckt. Verschlüsse müssen dabei locker sitzen, um ein Platzen der Gefäße zu vermeiden (Ausnahme: Autoklav mit Stützdruck). Bei Verwendung von Glasflaschen mit Schliffstopfen ist zwischen Flaschenschliff und Stopfen ein schmaler Streifen Aluminiumfolie oder Papier anzubringen. Das Ende des Streifens wird dazu umgeknickt und vor Einsetzen des Stopfens in die Flaschenöffnung gehängt. Den danach eingesetzten Stopfen deckt man mit Aluminiumfolie ab, so dass Verschluss und Flaschenhals bedeckt sind. Geräte, wie Pinzetten oder Spatel, werden in ein Becherglas gegeben, und der Behälter wird mit Aluminiumfolie abgedeckt. Bei geringem Verbrauch können Kleingeräte auch in größeren Petrischalen oder einzeln in Aluminiumfolie gewickelt sterilisiert werden.

Beim Beschicken eines Heißluftsterilisators ist darauf zu achten, ob das Material die erforderlichen hohen Temperaturen verträgt. Probleme bereiten dabei insbesondere Kunststoffartikel und Stopfen aus Zellstoff. Materialien, die nicht mindesten 160°C vertragen, sollten durch Autoklavieren sterilisiert werden (s.a. Abschnitt 2.2.3). Bei Kunststoffteilen, die Erhitzung vertragen, ist häufig die maximal zulässige Temperatur eingeprägt oder aufgedruckt. Die gebräuchlichen Laborflaschen mit blauen Schraubverschlüssen und Ausgießringen können nur bis 140°C autoklaviert werden; gleiche Flaschen mit etwas teueren roten Verschlüssen und Ausgießringen können bis 200°C erhitzt werden. Wenn Kunststoffartikel nicht mit der Angabe der maximal zulässigen Temperatur gekennzeichnet sind, helfen Nachfragen bei der Bezugsquelle weiter.

Die Hitzesterilisation kann durch Einwirkzeiten von mindestens zwei Stunden bei 160°C, einer Stunde bei 170°C oder einer halben Stunde bei 180°C erfolgen. Siehe hierzu auch die Hinweise in der DIN EN ISO 19458 (2006) oder im Deutsches Arzneibuch (DAB, 2006). Besonders bei großen Heißluftsterilisatoren ist die Aufheizzeit zu berücksichtigen. Auch ist darauf zu achten, dass die Luftumwälzung im Heißluftsterilisator nicht zu sehr durch dichte Beschickung behindert wird. An allen Wänden muss entsprechender Abstand eingehalten werden, bei großen Geräten sollte auch in der Mitte eine Schneise für Luftumwälzung freigelassen werden. Der Erfolg der Heißluftsterilisation ist mit Indikatoren regelmäßig zu überprüfen.

2.1.3 Lagerung von sterilen Labormaterialien

Es ist darauf zu achten, dass einmal sterilisierte Artikel nicht unbegrenzt lange steril bleiben. Glaspetrischalen müssen spätestens nach einer Woche Lagerung erneut sterilisiert werden, andere Laborartikel in der Regel nach einem Monat. Bereits sterilisierte Labormaterialien sind so zu lagern, dass immer die Artikel mit der längsten Lagerzeit zum Gebrauch entnommen werden. Es soll verhindert werden, dass nur ein Teil der Materialien umgeschlagen wird und der nicht umgeschlagene Rest überlagert wird. Als Merksatz hierzu hat sich der Begriff „LILO“ (Last In Last Out) etabliert. Die Länge der Lagerzeit ist für die verschiedenen Materialien durch Sterilkontrollen zu evaluieren und zu dokumentieren.

2.2 Herstellung und Aufbewahrung von Nährböden

Benedikt Schaefer

Die Herstellung der Nährböden ist in den einzelnen Kapiteln im Zusammenhang mit der Beschreibung des Untersuchungsverfahrens detailliert beschrieben. Hier sollen einige grundlegende Bemerkungen genügen. Hinweise finden sich auch in den Normen ISO/TS 11133-1 sowie dem Entwurf ISO 11133-2. Beide Normen gelten für Nährmedien aus der Lebensmittelmikrobiologie. Derzeit wird daran gearbeitet, die beiden Teile zu einer neuen einteiligen ISO 11133 mit Geltungsbereich für Lebensmittelmikrobiologie und Wassermikrobiologie fortzuentwickeln. Diese Norm wird Hinweise zu Qualitätskontrollen beim Hersteller sowie beim Verbraucher von Nährmedien enthalten. Dazu wird eine Liste mit Referenzstämmen aufgenommen, die für qualitative oder quantitative Qualitätskontrollen einzusetzen sind.

Nährmedien sind hitzeempfindlich. Sie sollten daher so schonend wie möglich erwärmt und autoklaviert werden. Die Gefäße für die Zubereitung von Nährmedien sollten so groß gewählt werden, dass der Inhalt auf einmal verbraucht wird.

2.2.1 Fertignährböden

Die Vorschrift zur Verwendung von Fertignährböden ist normalerweise auf den Behältern zu finden, in denen sie gekauft werden. Hersteller von mikrobiologischen Medien oder einzelnen Bestandteilen bieten häufig ein Buch über die Verwendung, Zubereitung und Zusammensetzung der Medien an. Da Angaben zur Charge und zum Haltbarkeitsdatum auf der Handelspackung zu finden sind, sollten die Medien nicht umgefüllt werden. Die Größe der Packungseinheiten und die jeweils bestellte Menge müssen sich am Verbrauch orientieren. Die Lagerung erfolgt trocken und dunkel bei Raumtemperatur in den dicht verschlossenen Behältern. Nach Überschreiten des Mindesthaltbarkeitsdatums dürfen Medien und ihre Bestandteile nicht mehr verwendet werden. Verklumpte Pulver und Granulate sind zu verwerfen. Es werden gebrauchsfertige Petrischalen, Kolben, Flaschen oder Nährkartonscheiben mit verschiedenen Nährmedien angeboten. Bei allen Produkten dieser Art wird die Verwendung vom Hersteller genau beschrieben. Trotz großer Anstrengungen der Hersteller zur Chargenkontrolle ist eine Eingangskontrolle der Fertignährböden beim Kunden unverzichtbar. Sinnvoll ist in diesem Zusammenhang die Verwendung von Regelkarten zur Überprüfung des möglichen Einflusses von Chargenwechseln auf das Untersuchungsergebnis (s. Kapitel 3). Dabei sollten die Nährböden so überprüft werden, wie es dem späteren Einsatz bei Untersuchungsaufträgen entspricht. So muss zum Beispiel bei Medien, die für Membranfiltrationen eingesetzt werden, auch die Chargenkontrolle mit Membranfiltrationsansätzen durchgeführt werden.

2.2.2 Zubereitung

Die meisten Nährmedien werden in Pulver- oder Granulatform angeboten. Diese werden gegebenenfalls mit den weiteren Bestandteilen des Mediums in ein genügend großes Gefäß eingewogen und durch Zugabe von entsalztem oder frisch destilliertem Wasser aufgeschlämmt. Die Bestandteile werden durch Umschütteln und bei agarhaltigen Medien nach ca. 20-minütigem Quellenlassen durch Erhitzen im Dampftopf gelöst. Erst wenn die Lösung homogen ist, kann der pH-Wert mittels Indikatorpapier oder hitzebeständiger Elektrode kontrolliert und gegebenenfalls korrigiert werden. Dabei ist die Abhängigkeit des pH-Wertes von der Temperatur zu beachten. Nach Einstellen des pH-Wertes wird mit Aqua dest. zum Endvolumen aufgefüllt. Als Gefäße für die Zubereitung von Nährmedien haben sich neben Glaskolben und „Nährbodenflaschen“, die mit Kappen oder Stopfen verschlossen werden, auch Laborglasflaschen mit Schraubverschluss durchgesetzt.

2.2.3 Sterilisation

Sie ist im Anschluss an die Bereitung des Nährbodens erforderlich, weil Peptone bzw. Trockennährboden immer in geringem Maße keimhaltig oder sporenhaltig sind. Die Sterilisation erfolgt im Autoklav bei 121°C in 15–20 min. Die Zeitspanne vom Erreichen d...

Inhaltsverzeichnis

• Cover
• Series Page
• Title page
• Copyright
• Geleitwort
• Autorenverzeichnis
• 1: Allgemeines
• 2: Methodische Grundlagen
• 3: Qualitätssicherung
• 4: Bakteriologische Wasseruntersuchung
• 5: Virologische und protozoologische Wasseruntersuchungen
• 6: Molekularbiologische Methoden
• 7: Spezifische Kriterien
• 8: Bewertung
• 9: Anhang
• Sachregister