Modulares Laborrobotersystem

zur Durchführung biologischer Hochdurchsatzuntersuchungen

Alexander Pfriem

• Verlag: De Gruyter Oldenbourg
• Jahr: 2017
• eBook-ISBN: 9783110524598
• Auflage: 1
• Thema: Technik & Maschinenbau
• Thema: Medizinische Theorie, Praxis & Referenz

Es wird die Entwicklung eines modularen Robotersystems beschrieben, das bisher manuell erledigte Arbeitsschritte automatische durchführt. Ziel einer solchen Automatisierung ist einerseits den nötigen Persomal- und Kostenaufwand zu reduzieren und wissenschaftiche Erkentnisse schneller und leichter zu erzielen. Hierzu werden ein Roboter zur Probevorbereitung und ein Roboter zur zweistufigen Untersuchung von Proben mit automatischer Erkennung des interessierenden Bereiches entwickelt. Ein weiterer Aspekt ist die Steigerung der Effizienz hochauflösender, bildgebender Laboranalytik. Hierzu werden zwei einfache automatische bildgebende Roboter entwickelt, mit denen eine Vorauswahl der für weitere Untersuchungen interessanten Proben automatisch durchgeführt wird. Um eine automatische Gesamtprozesskette zu ermöglichen, wird ein auf die Einzelroboter abgestimmtes Transportsystem entwickelt, das den Transport von Mikrotiterplatten zwischen den Funktionseinheiten übernimmt. Zur Umsetzung der Einzelfunktionen werden Bildverarbeitungsmittel zur Erkennung von Informationen in Bildern in automatischen Algorithmen implementiert.

1Einleitung

Im vorliegenden Buch wird ein neues Konzept zur Automatisierung von Hochdurchsatzverfahren in der Bioanalysetechnik vorgestellt. In der Bioanalysetechnik werden Grundlagen zu biologischen Entwicklungsprozessen untersucht und Krankheitsmechanismen werden erforscht. Zum Verständnis von normalen und krankhaften Prozessen, wie sie gesteuert werden und wie die Steuerung beeinflusst werden kann, ist Bioanalysetechnik essenziell.

Anhand von Grundlagenuntersuchungen sollen biologische Vorgänge nachvollzogen werden. Das abgeleitete Grundverständnis kann dann dazu genutzt werden, komplexere Systeme zu analysieren, um dann möglicherweise auch biologische Prozesse beeinflussen zu können. Mit den erzielten Erkenntnissen über biologische Systeme können auch beim Menschen zielgerichtet Heilmittel und -methoden gegen Krankheiten entwickelt werden. Im besten Fall könnten krankhafte Prozesse wie Fehlentwicklungen oder gar Krebs gezielt korrigiert werden. Die Motivation biologische Abläufe zu erklären, ist der Leitgedanke des Helmholtz-Programms Bio-Interfaces. In dem interdisziplinären Programm werden biologische Schnittstellen, interzelluläre Kommunikation und genetische Steuerung biologischer Vorgänge erforscht. Neben der Biologie wird in verschiedenen Fachgebieten an Technologien geforscht, die die Durchführung der biologischen Untersuchungen vorantreiben, erleichtern und verbessern können. So arbeiten Chemiker an der effizienten Synthese von nötigen Untersuchungssubstanzen, Informatiker an schneller, systematischer Datenverarbeitung und Ingenieure an Automatisierungstechnik zur Beschleunigung der Untersuchungen.

Das vorliegende Werk leistet einen Beitrag zur Automatisierung von Hochdurchsatzverfahren. Hochdurchsatzuntersuchungen (engl. high-throughput screening, HTS) mit Zebrabärblingen haben sich seit den 1990er-Jahren zu einem sehr wichtigen Arbeitsfeld entwickelt. Aktuelle Untersuchungen mit Zebrabärblingen sind im Durchsatz dadurch beschränkt, dass einige Prozessschritte nur manuell durchgeführt werden können. Das Werk beschäftigt sich mit der Konzeption und Entwicklung von Automatisierungslösungen für Hochdurchsatzuntersuchungen mit Zebrabärblingen. Ziel der Automatisierung von biologischen Untersuchungen ist es, den nötigen Personal- und Kostenaufwand zu reduzieren und wissenschaftliche Erkenntnisse schneller und leichter erreichbar zu machen. Durch Automatisierung werden systematische Untersuchungen mit großem Umfang ermöglicht, die mit manuellem Aufwand unwirtschaftlich und langwierig sind. Das Verstehen von biologischen Zusammenhängen sowie die Suche nach biologisch aktiven Wirkstoffen kann damit beschleunigt werden.

1.1Bedeutung von Hochdurchsatzverfahren

Hochdurchsatzverfahren sind Untersuchungsmethoden, bei denen systematisch eine Vielzahl von Proben auf bestimmte Kriterien geprüft wird. Hochdurchsatzverfahren bestehen aus Einzeltätigkeiten, die nacheinander ausgeführt werden. Zu Beginn der Untersuchung werden die Proben in geeigneten Untersuchungsgefäßen vorbereitet. Die eigentliche Untersuchung ist meist die Zugabe von Substanzen oder das Einwirken chemischer oder physikalischer Einflüsse, sodass eine Reaktion mit den Proben stattfindet. Nach der Reaktion werden die Proben begutachtet und die Reaktion wird ausgewertet. Systematische Untersuchungen der Bioaktivität von Substanzen mit Probendurchsätzen von mehr als 10 000 Proben pro Tag werden als Hochdurchsatzscreenings bezeichnet [1]. Zellbasierte Screenings können schon ab wenigen 100 Proben pro Tag als Hochdurchsatzuntersuchung gelten, da die Handhabung von lebenden Zellen wesentlich anspruchsvoller ist [2].

Hochdurchsatzverfahren mit riesigen Probenumfängen sind von großer Bedeutung bei der Entschlüsselung biologischer Prozesse und deren Steuerungsmechanismen, bei toxikologischen Untersuchungen in Medikamentenzulassungsverfahren und bei Untersuchungen von Umweltstoffen auf ihre Schädlichkeit. Die technische Analyse biologischer Prozesse wird als Biotechnologie bezeichnet. Die Biotechnologie beschäftigt sich mit der kommerziellen Nutzung von biologischem Grundlagenwissen [3]. Zur Anwendung des Grundlagenwissens sowie zur Erlangung neuer Grundlagenerkenntnisse wird Bioanalysetechnik verwendet. Der Einsatz von Bioanalysetechnik erstreckt sich von entwicklungsbiologischer Grundlagenforschung über Medizintechnik zum Verständnis von Krankheiten bis hin zu kommerziellem Einsatz in der Medikamentenentwicklung. Zur Aufdeckung und zum Verstehen von biologischen Prozessketten werden normale und krankhafte Abläufe untersucht. Normal ablaufende entwicklungsbiologische Prozesse zu verstehen und zu entschlüsseln, ist ein wichtiges Forschungsgebiet in der Bioanalysetechnik. Ein weiteres Arbeitsgebiet ist das Verstehen der Entstehung von Krankheiten und darauf aufbauend die Suche nach Methoden, um Heilmittel zu finden. Normale Entwicklungsprozesse, die es zu verstehen gilt, sind beispielsweise die Embryonalentwicklung, die Spezialisierung von Zellen während der Embryonalentwicklung sowie Regenerationsprozesse und Selbstheilung. Für krankhafte Prozesse wie Fehlentwicklungen, Tumorbildung und Krebs sollen gezielte Heilmittel entwickelt werden. Die genannten Prozesse funktionieren über komplexe Biosignalwege, die durch Genetik und Botenstoffe gesteuert werden. Die Herausforderung ist es, die Entwicklungsprozesse zu entschlüsseln und das erworbene Wissen im Kampf gegen verschiedenste Krankheiten und Defekte einzusetzen [4].

Die Anforderung, hohe Probenumfänge untersuchen zu müssen, ergibt sich aus der Komplexität biologischer Prozesse. Biologische Prozesse funktionieren über komplexe Steuerungsmechanismen und Signalwege. Gene beinhalten die Information zur Synthese von Proteinen. Proteine erfüllen diverse Funktionen als Botenstoffe, Rezeptoren oder Zellbausteine. Während ein biologischer Prozess abläuft, kommt es meist zur Umwandlung und Reaktion diverser Substanzen. Dabei werden häufig Zwischenstadien eingenommen, die sich gegenseitig beeinflussen. Kleine Änderungen von einzelnen Reaktanten können weitreichende Folgen haben. Unbekannte Biosignalwege müssen häufig nach dem Trial-and-Error-Prinzip entschlüsselt werden. Dabei entstehende Zwischenstadien können nicht einfach simuliert werden, sondern müssen experimentell bestimmt und nachgewiesen werden. Wirkungen von bioaktiven Substanzen zur Beeinflussung biologischer Prozesse können nicht einfach aufgrund der Molekülstruktur der zu betrachtenden Substanz vorhergesagt werden [3, 5]. Daher sind zur Entschlüsselung der Zusammenhänge zwischen Chemikalien und ihrer biologischen Aktivität riesige Probenumfänge nötig [6, 7]. In sogenannten small molecule screens werden ganze Molekülbibliotheken auf ihre Wirkung überprüft [5, 8, 9]. Jeder möglicherweise bioaktive Stoff wird dabei in verschiedenen Konzentrationen in Experimenten an Modellorganismen getestet. Ein solches, flächendeckendes Vorgehen dient dazu, bisher unbekannte bioaktive Stoffe zu identifizieren, um in weiteren Untersuchungen deren Wirkung genauer zu erforschen. Die beschriebene Vorgehensweise des Testens von Substanzen auch in verschiedenen Konzentrationen hat große Probenumfänge zur Folge [10, 11]. Aufgrund der Notwendigkeit des Tests vieler Tausend Substanzen, da keine a priori-Abschätzung zur Wirkung gemacht werden kann, sind Probenumfänge von mehreren Zehntausend Proben schnell erreicht. Beispielsweisewurden in einem small molecule screen systematisch 5000 Substanzen mit Zebrabärblingmutanten auf ihre Eignung getestet, eine bestimmte Entwicklungsstörung zu heilen [5, 12]. Es wurden dabei zwei neue Substanzen gefunden, die eine vielversprechende Wirkung hatten. In einer weiteren Versuchsreihe wurde eine Molekülbibliothek mit 16 320 Stoffen (engl. compounds) untersucht. Pro Woche wurden 1000 Substanzen an Zebrabärblingmutanten auf ihre Wirkung getestet. Die Durchführung der Testreihe dauerte also 16 Wochen lang. Als Ergebnis wurde ein Molekül gefunden, das die Krebshäufigkeit bei den getesteten Mutanten erniedrigt hat [5]. Mit entsprechender Automatisierungstechnik können solche Untersuchungen mit weniger Personalaufwand und schneller durchgeführt werden.

Ein weiterer Aspekt, der hohe Probenumfänge nötig macht, ist die Existenz gesetzlicher Regelungen für die Sicherheit verschiedener Produkte und Stoffe. In Medikamentenzulassungsverfahren müssen beispielsweise mit potenziellen Wirkstoffen gegen Krankheiten weitere, zahlreiche Untersuchungen durchgeführt werden. Auch durch verschiedene gesetzliche Vorgaben und Richtlinien für Standardtestverfahren werden immense Probenumfänge gefordert. Die EU-Verordnung Nr. 1907/2006 „REACH“ gibt Testvorschriften für die Toxizität von Stoffen vor, die in der Umwelt vorkommen [13]. Neben anderen Modellorganismen eignet sich der Zebrabärbling (Danio rerio) aufgrund seiner herausragenden Eigenschaften besonders für Hochdurchsatzuntersuchungen. Es wurden für Zebrabärblinge Untersuchungsprotokolle in Standards und Richtlinien definiert. Durch solche Standarduntersuchungsmethoden werden ebenfalls große Probenumfänge erforderlich. So wird z. B. mit DarT [14]ein Standardtestverfahren beschrieben, mit dem toxikologische Untersuchungen von Abwässern vorgenommen werden können. Die Testsystematik wurde von der OECD in der Richtlinie fish embryo test FET [15] umgesetzt. Auch die deutsche Norm DIN EN ISO 15088 [16] beschreibt die Eignung und Besonderheiten beim Einsatz von Fischembryos zur Bestimmung der Toxizität von Abwässern. In der Norm werden sogenannte toxikologische Endpunkte an Zebrabärblingen definiert, anhand derer Schäden in der Entwicklung des Organismus erkannt werden können. Toxikologische Endpunkte sind u.a. Koagulation1 (Denaturierung der Proteine in einem abgestorbenen Fischei), fehlender Herzschlag und fehlende Spontanbewegung. Die Vorgabe eines Kataloges an typischen Erkennungsmerkmalen ermöglicht die Untersuchung von großen Probenumfängen mit standardisierten Methoden.

Die Größe der Probenumfänge ist im Normalfall schon durch die Eingangsfragestellung vorgegeben, sodass zur wirtschaftlichen und rationellen Durchführbarkeit von Hochdurchsatzverfahren die nötige Zeit sowie die zu erzeugenden Datenmengen auf ein notwendiges Minimum beschränkt werden sollen. Hochdurchsatzvorhaben sind ohne Automatisierungstechnik nicht mit rationellem Personaleinsatz durchführbar. Auch bei niedrigeren Durchsatzgeschwindigkeiten ist der Einsatz von Robotern sehr vorteilhaft, da monotone, tausendfach zu wiederholende Tätigkeiten zuverlässig und schnell erledigt werden. Ein Hauptaspekt zur Eröffnung der Möglichkeit von Hochdurchsatzscreenings mit großen Probenumfängen ist das Substituieren von manuellen Arbeitsschritten durch automatische Abläufe [17, 18]. Die Aufgabe für Ingenieure liegt darin, Automatisierungslösungen zu entwickeln, die Eingriffe durch Menschen vermeiden, die Untersuchungszeit reduzieren und die Möglichkeit zum parallelen Untersuchen mehrerer Proben bieten [19].

1.1.1Biologische Untersuchungen...

Inhaltsverzeichnis

• Cover
• Titelseite
• Impressum
• Inhalt
• Vorwort
• 1 Einleitung
• 2 Neues Konzept für ein automatisches Hochdurchsatzverfahren
• 3 Entwicklung des Fischsortierers
• 4 Entwicklung der Mikroskope
• 5 Entwicklung des Transportsystems
• 6 Zusammenfassung
• A Anhang
• Abbildungsverzeichnis
• Tabellenverzeichnis
• Literatur
• Stichwortverzeichnis