Der Gradient in der HPLC für Anwender

RP, LC-MS, Ionenanalytik, Biochromatographie, SFC, HILIC

Stavros Kromidas

• Verlag: Wiley-VCH
• Jahr: 2019
• ISBN drucken: 9783527344048
• eBook-ISBN: 9783527812738
• Auflage: 1
• Thema: Physical Sciences
• Thema: Analytic Chemistry

Erstmalig werden in einem Buch alle Aspekte der HPLC-Gradientenelution in den unterschiedlichen Trennmodi umfassend behandelt. Der Anwender findet konkrete Hinweise zur Optimierung von klassischen Lösungsmittelgradienten für RP- und LC-MS-Trennungen neben wertvollen Hinweisen zum Einsatz von Salz-, pH-Wert- und Temperaturgradienten - praxisnah und mit zahlreichen Beispielen.
Teil 1
Aspekte der Gradienten-Optimierung in der RP-Chromatographie
Apparative Einflüsse auf die Qualität von Gradienten-Methoden und deren Übertragung zwischen unterschiedlichen Geräten
Optimierung einer Reversed Phase Gradiententrennung mit EXCEL
Teil 2
Die Gradientelution ionischer Verbindungen
Der Gradient in der Biochromatographie
Spezifika der Gradientenelution in der HILIC
Spezifika der Gradientenelution in der SFC
Der Gradient in LC-MS-Messungen

Teil 1
Die Grundsätze der Gradientenelution

1
Aspekte der Gradienten-Optimierung

Stavros Kromidas

1.1 Einführung

Gradienten sind vielfältig einsetzbar und finden daher eine breite Anwendung. So sind beispielsweise Gradienten bei der Methodenentwicklung von unbekannten Proben ebenso unverzichtbar, wie für die Quantifizierung im Spurenbereich. Der theoretische Hintergrund der Gradientelution ist recht komplex, denn: Das Geschehen in der Säule während einer Gradientelution wird im Vergleich zu isokratischen Trennungen von mehr Faktoren beeinflusst, diese wirken darüber hinaus teilweise entgegengesetzt oder multiplikativ. Im vorliegenden Beitrag werden wir ausschließlich einige Aspekte der Optimierung von Gradiententrennungen in der RP-Chromatographie in bewusst einfacher Form vorstellen. Weitere wichtige Gesichtspunkte des Gradienten wie Theorie, Apparatives und Troubleshooting sind anderen Quellen vorbehalten [1–4]. Zunächst erfolgt eine kurze Beschreibung des Wirkens eines Gradienten in der Säule, anhand einiger Grundformeln wird anschließend auf die Charakteristika/Besonderheiten des Gradienten eingegangen. Darauf aufbauend werden Möglichkeiten der Optimierung für folgende Zielsetzungen aufgezeigt: niedrige Nachweisgrenze, hohe Peakkapazität, ausreichende Auflösung sowie möglichst kurze Retentionszeiten. Zum Schluss erfolgt eine Zusammenfassung mit einigen Grundregeln und Empfehlungen.

1.2 Besonderheiten des Gradienten

In der HPLC herrschen üblicherweise während der Trennung unterschiedlich starke Wechselwirkungen zwischen den Analyten einerseits sowie den Eluentenbestandteilen andererseits und der stationären Phase. Bei isokratischen Trennungen liegt eine vorgegebene, konstante Eluentenzusammensetzung vor, die Konsequenz lautet: Während des Chromatographielaufs findet eine konstante, gleichstarke Wechselwirkung der Eluentenmoleküle mit dem Phasenmaterial statt.

Was passiert nun beim Gradienten? Bei Gradiententrennungen nimmt die Elutionsstärke der mobilen Phase zu, ihre Wechselwirkung mit der stationären Phase nimmt im Gradientenverlauf somit ebenfalls zu. In der RP-Chromatographie gilt: Je organischer, apolarer/hydrophober der Eluent im Laufe der Trennung wird (immer mehr % B, ACN oder MeOH), umso stärker wird seine Wechselwirkung mit der organischen, apolaren Oberfläche eines RP-Materials – es gilt ja „Gleiches mit Gleichem“, d. h. die apolaren ACN- oder MeOH-Moleküle „mögen“ naturgemäß z. B. apolare C₁₈-Alkylgruppen.

Die Substanzmoleküle bekommen nun im Gradientenverlauf aufgrund der immer stärker werdenden Konzentration an ACN/MeOH-Molekülen eine gebührende Konkurrenz bei ihren Wechselwirkungen mit den C₁₈-Alkylgruppen. Sie werden dadurch immer stärker gezwungen, die stationäre Phase schneller zu verlassen, gelangen früher in die mobile Phase und eluieren somit auch früher im Vergleich zu isokratischen Trennungen. Bei 100 % MeOH bzw. ACN am Ende des Gradienten eluieren sogar die sehr hydrophoben Komponenten der Probe, evtl. auch hartnäckige organische Verunreinigungen, die sich womöglich an der Oberfläche der stationären Phase angesammelt haben mögen – die Säule wird nebenbei gespült.

Beim Gradienten haben wir mit Fokus auf die Peakform zwei entgegengesetzte Tendenzen: Je später die Peaks eluieren, umso stärker unterliegt einerseits die Substanzzone Dispersionsvorgängen in der Säule und somit nimmt zunächst auch die Bandenverbreiterung zu – analog zu isokratischen Trennungen. Andererseits wird im gleichen Maße die Beschleunigung der wandernden Substanzzone immer stärker, da ja die Elutionsstärke des Eluenten von Anfang bis Ende permanent zunimmt. Ergebnis: Diese Effekte kompensieren sich und wir erhalten beim Gradienten in der Regel schmale Peaks. Merke: Beim Gradienten ergibt sich eine stete Aufkonzentrierung der Elutionsbande und damit eine geringe Bandenverbreiterung im Vergleich zu isokratischen Trennungen, was in der Konsequenz niedrige Nachweisgrenzen zur Folge hat.

Das trifft sowohl für den vorderen als auch für den hinteren Teil des Chromatogramms zu, im idealen Fall bleibt die Peakbreite konstant. Aus diesem Grunde ist im Zusammenhang mit dem Gradienten nicht statthaft, von einer „Bodenzahl“ zu sprechen: Die Bodenzahl, ein Maß für die Bandenverbreiterung, ist nur für isokratische Bedingungen definiert. Das hier beschriebene Phänomen bedeutet u. A. für die Praxis, dass eine nachlassende Packungsqualität und eine sub-optimale Hardware (apparative Totvolumina), die bei isokratischen Trennungen zu breiten Peaks führen, sich bei Gradiententrennungen nicht so stark bemerkbar machen: Auch an „schlechten“ Geräten und mit „schlechten“ Säulen sehen Chromatogramme bei einer Gradientelution ordentlich aus, vor allem dann, wenn der Gradient steil ist und ACN als organischer Anteil des Eluenten benutzt wird – eine willkommene Tatsache für Beispielchromatogramme in Herstellerprospekten.

Das Positive aus Anwendersicht: Einfache Gradiententrennungen an 20–50 mm-Säulen an konventionellen Apparaturen erweisen sich in der Regel als unproblematisch, jedenfalls was die Peakform betrifft. Auch der Vorteil von kleineren Korngrößen z. B. 2 oder 3 μm-Teilchen gegenüber 5 μm-Teilchen ist bei zahlreichen Applikationen weniger relevant. So sollte im Falle einer schwierigen Matrix zunächst an 3,5–5 μm-Material gedacht werden. Es sei denn, man hat eine große Zahl von sehr ähnlichen Analyten zu trennen – in diesem Fall kommt die Trennschärfe von sub ≤ 2 μm-Teilchen selbstverständlich auch beim Gradienten zum Tragen. In diesem Zusammenhang sei auch auf folgendes hingewiesen: Da der Eluent permanent stärker (= apolarer) wird, sind die wandernden Substanzmoleküle am Ende eines Peaks, also an der hinteren Flanke, schneller als am Anfang des Peaks, die später eluierenden Moleküle der Substanzbande werden stets schneller nach „vorne“ geschoben. Diese Tatsache, als „Peakkompression“ bekannt, führt dazu, dass bei Gradiententrennungen selten ein Tailing beobachtet wird. Die Peaksymmetrie ist um ca. 10 % besser im Vergleich zu einem isokratischen Lauf bei äquivalenter Eluentenzusammensetzung (Hans-Joachim Kuss, persönliche Mitteilung).

1.3 Einige chromatographische Größen und Formeln

Betrachten wir jetzt einige chromatographische Größen, die aus der Theorie – die übrigens ursprünglich für die GC und wesentlich später für isokratische LC-Trennungen entwickelt worden ist – bekannt sind. Auf das Ableiten der verwendeten Formeln weiter unten wird verzichtet, vielmehr werden sie lediglich benutzt, um die Konsequenzen für die Optimierungspraxis herauszuarbeiten. Für eine detailliertere Diskussion, s. [2–4] und insbesondere [1]. Die Auflösung R („Resolution“) ist vereinfacht der Abstand zweier Peaks an der Basislinie. Der Retentionsfaktor k (früher: Kapazitätsfaktor k′) ist das Verhältnis der Aufenthaltszeit einer Komponente in/an der stationären Phase und der mobilen Phase, das ist also der Quotient aus der Nettoretentionszeit

(Aufenthaltszeit an der stationären Phase) und der Durchfluss- oder Tot- oder Mobilzeit t₀ bzw. t_m (Aufenthaltszeit in der mobilen Phase). Er stellt somit ein Maß für die Stärke der Wechselwirkungen dieser Komponente an dieser Säule bei diesen Bedingungen dar:

. Der Retentionsfaktor ist allerdings beim Gradienten nicht konstant: sehr groß am Anfang (die Substanzen „kleben“ bei 100 oder 95 % Wasser/Puffer regelrecht am Anfang der stationären Phase), im Laufe der Trennung kleiner werdend und am Ende des Gradienten ist er sehr, sehr klein (bei 90 oder 100 % MeOH oder ACN haben die Substanzmoleküle kaum eine Chance sich auf der stationären Phase aufzuhalten, denn die Konkurrenz um die „Gunst“ der C₁₈-Gruppen ist nun riesig geworden). Vereinfacht gesagt: Bei einem Gradienten von 100 % Wasser/Puffer auf 100 % MeOH/ACN ist der k-Wert am Anfang quasi unendlich – in manchen Literaturstellen werden Zahlen zwischen 3500 und 4000 genannt – und am Ende nahezu null. Da sich der k-Wert während der Gradientelution ändert, wurde mit dem Ziel dieser Besonderheit Rechnung zu tragen, ein k*-Wert (oder

) eingeführt [1]: Das ist der k-Wert einer Komponente, wenn sie sich gerade in der Mitte der Säule befindet. Obwohl die Notwendigkeit einer derartigen Größe zum Beschreiben des Gradienten hinterfragt werden darf, wird hier der k* – Wert verwendet, da er für unsere Betrachtungen Vorteile bringt. Und dass die Wechselwirkung und somit ein Maß für sie, also eine Retentionsgröße, für Optimierungsüberlegungen wichtig ist, leuchtet ein – wie auch immer eine derartige Größe definiert sein mag. Der Trennfaktor α ist der Quotient aus den Retentionsfaktoren zweier Komponenten, die man trennen möchte, k₁ und k₂, und stellt die Trennfähigkeit des chromatographischen Systems für diese zwei Komponenten dar. In der Literatur werden für R und k^* unterschiedliche Formeln verwendet. Sie sind jedoch recht ähnlich und führen letzten Endes zu ähnlichen Zahlenwerten und somit zu ähnlichen Aussagen, wenn der Fokus auf die Praxis gerichtet ist. Dazu folgendes Beispiel: In Formel (1.1), s. weiter unten, wird in der Literatur für den zweiten Term (Selektivitätsterm) neben (α – 1) auch ln α bzw. α – 1/α verwendet. Bei einem angenommenen α-Wert von 1,05 ergeben sich folgende Zahlenwerte für den Selektivitätsterm: 0,048, 0,049 und 0,050. Diese unterschiedlichen Zahlen beeinflussen jedoch den Wert für die Auflösung lediglich in der zweiten Stelle nach dem Komma. Nachfolgend sind fünf einfache Formeln angegeben. Sie reichen aus, um Schlussfolgerungen für die Optimierungspraxis zu ziehen.

(1.1)

(1.2)

(1.3)

(1.4)

(1.5)

mit

R	Auflösung,
N	Bodenzahl, grundsätzlich für isokratische Bedingungen d...

Inhaltsverzeichnis

• Cover
• Inhaltsverzeichnis
• Vorwort
• Zum Aufbau des Buches
• Zu den Autoren
• Beitragsautoren
• Teil 1: Die Grundsätze der Gradientenelution
• Teil 2: Die Spezifika des Gradienten in einzelnen Trennmodi
• Stichwortverzeichnis
• Endbenutzer-Lizenzvereinbarung