Anne Gompf
1Grundlagen der Durchflusszytometrie
1.1Einleitung
Ein Durchflusszytometer ist im Grunde genommen ein automatisiertes Fluoreszenzmikroskop. Durchflusszytometrisch können oberflĂ€chliche und innere Merkmale von biologischen Einzelzellen oder Ă€hnlich groĂen Partikeln in einer durch das Zytometer flieĂenden Suspension bestimmt werden, die als optische Eigenschaften mittels Lichtstreuung und Fluoreszenzmarkierung fĂŒr das GerĂ€t detektierbar gemacht worden sind.
Dabei wird der Begriff FACS = fluorescence-activated cell sorting oder sorter, der eigentlich Zellsortierung bedeutet und eine Handelsmarke ist, synonym fĂŒr die analytische Durchflusszytometrie gebraucht.
Ăhnlich wie im Mikroskop werden auch im Durchflusszytometer die zu beurteilenden Objekte (Zellen) beleuchtet. Allein die Dauer dieser Beleuchtung ist bei letzterem mit ungefĂ€hr einer bis zehn Mikrosekunden um ein Vielfaches kĂŒrzer. Damit lĂ€sst sich eine schnellere Beurteilung des einzelnen Objekts und damit der ganzen Probe erreichen, bedingt aber auch den Einsatz von Lichtquellen höherer IntensitĂ€t (Laser).
FĂŒr die Durchflusszytometrie geeignete Partikel sind klassischerweise 0,2 ÎŒm bis 150 ÎŒm groĂ und können eukaryotische Einzelzellen, Bakterien oder auch Chromosomen oder Beads sein. Zellen aus GewebeverbĂ€nden mĂŒssen (mechanisch, enzymatisch) aus diesen herausgelöst werden um eine Einzelzellsuspension herzustellen.
In diesem Kapitel soll neben dem Aufbau und der Funktionsweise eines Durchflusszytometers auch Fluoreszenz als solche und deren Nutzung in der Durchflusszytometrie besprochen werden.
1.2Durchflusszytometer
1.2.1Das FlĂŒssigkeitssystem
Zellen in Einzelzellsuspension in Pufferlösung flieĂen als Probenstrom durch das System vorbei an einem oder mehreren Lasern â danach im Fall der reinen Analyse in den MĂŒll, im Fall der Sortierung werden jetzt gewĂŒnschte Populationen aufgefangen (Abb. 1.1).
FĂŒr eine gleichmĂ€Ăige Anregung der Fluorochrome ist es wichtig, dass die Zellen in der Probe einzeln nacheinander in einem Fokuspunkt an den Lasern vorbeiflieĂen.
Abb. 1.1: Funktionsprinzip und schematische Darstellung eines einfachen Durchflusszytometers mit Laser, Streulicht- und Fluoreszenzdetektoren und Sortierfunktion. PD = Photodiode, PMT = Photomultiplier Tube (modifiziert nach Givan, 2001; abgedruckt mit Genehmigung von John Wiley Sons, Inc.).
Dazu wird in den meisten Durchflusszytometern der Probenstrom in der Flusskammer (Flow Chamber, Flow Cell) in die Mitte des HĂŒllstroms injiziert und dort als Kernstrom hydrodynamisch fokussiert: dank des DruckgefĂ€lles zwischen HĂŒllund Probenstrom wandern die Zellen ins Zentrum des Stroms (Bernoulli-Effekt).
Die HĂŒllflĂŒssigkeit ist in nahezu allen FĂ€llen eine gepufferte Salzlösung (PBS), da biologische Zellen darin ĂŒberleben und da vor allem zum Sortieren eine leitfĂ€hige FlĂŒssigkeit benötigt wird. In Analysemaschinen kann theoretisch auch Wasser als HĂŒllflĂŒssigkeit verwendet werden, da sich bei laminaren Strömen HĂŒll- und Probenstrom nicht vermischen.
Abb. 1.2: Schematische Darstellung eines Teils einer Flusszelle mit niedriger und hoher Flussrate â schmalem und breitem Probenstrom â wĂ€hrend der hydrodynamischen Fokussierung.
Bei Erhöhung der Probenflussrate wird der Kernstrom durch Drucksteigerung im Probenstrom verbreitert und es können mehr Zellen pro Zeiteinheit gemessen werden (Abb. 1.2). Da auf Grund des breiteren Probenstroms einzelne Zellen nicht mehr genau im Laserfokus liegen, werden die Signale bei schnellerer Messung unschÀrfer.
Die SignalunschĂ€rfe bei schneller Messung und die auĂerdem auf Grund der ScherkrĂ€fte wĂ€hrend der hydrodynamischen Fokussierung auftretende Deformation der Partikel können z. B. in GerĂ€ten mit akustischer Fokussierung umgangen werden (AttuneÂź, life Technologies). Hier werden die zu untersuchenden Partikel mittels Schallwellen von ĂŒber 2 MHz aus einem piezzoelektrischen UltraschallgerĂ€t fokussiert. Daneben gibt es noch das GuavaÂź easyCyteTM-System von Merck Millipore, welches mittels Spritzenpumpe den reinen Probenstrom durch eine Mikrokapillare schickt und so völlig ohne HĂŒllflĂŒssigkeit auskommt.
GerĂ€te, in denen die Zellsuspension mit Spritzenpumpen eingebracht werden wie z. B. bei AttuneÂź und GuavaÂź, aber auch GerĂ€te, in denen die Probe mit Vakuum angesaugt wird wie beim BD FACSVerseTM, erlauben dank genau definierter Volumina auĂerdem die Bestimmung der Zellkonzentration in der Probe.
In durchflusszytometrischen AnalysegerĂ€ten folgt auf den Schnittpunkt von fokussierten Zellen mit Laserstrahl(en) die Entsorgung der jetzt vermessenen Probe. Mit ZellsortiergerĂ€ten können an dieser Stelle mehrere ĂŒber die soeben gemessenen Eigenschaften charakterisierte Zellsubpopulationen aufgefangen und weiteren Analysen zugefĂŒhrt werden.
Die Sortierung von Zellen ist eigentlich eine Sortierung von Tropfen, in denen sich jeweils eine Zelle befindet. Dazu wird der Strom aus Probe und HĂŒllflĂŒssigkeit in Schwingungen versetzt, sodass nach Austritt aus der Flusszelle Tropfen vom bis dahin kontinuierlich flieĂenden Strom abreiĂen, die â selbst mit einer Ladung versehen â daraufhin in einem elektromagnetischen Feld vom Hauptstrom abgelenkt werden können. Die GröĂe der Tropfen und damit auch die Geschwindigkeit ihrer Generierung wird durch die GröĂe der Austrittsöffnung â der DĂŒse oder Nozzle â bestimmt. Je kleiner die DĂŒse, desto kleiner die Tropfen, desto schneller ihre Entstehung und auch die Sortierung. Diesen Tropfen wird unmittelbar am Abrisspunkt je nach gewĂŒnschter Auffangposition und dazu benötigtem Ablenkwinkel eine mehr oder weniger groĂe Ladung verliehen. Im elektromagnetischen Spannungsfeld zwischen zwei gegensĂ€tzlich geladenen Ablenkplatten fliegen diese Tropfen mit den enthaltenen Zellen zu ihren jeweiligen Auffangröhrchen oder Plattenlöchern oder auf ObjekttrĂ€ger (Abb. 1.1).
Neben dieser elektrostatischen Art der Sortierung gibt es auch mechanische Sortiermechanismen, bei denen die zu sortierenden Partikel mit einem Fangröhrchen eingesammelt werden (BD FACSCaliburTM) oder mit Hilfe eines akustischen Pulses abgelenkt werden (Partec). Die mechanische Variante hat die Vorteile, dass man mit dieser sanften Methode auch empfindliche Zellen sortieren kann, diese Art der Sortierung keine Aerosole produziert und im geschlossenen System keine Umweltkontaminationen in die Probe eindringen können. Nachteile sind die geringere Sortiergeschwindigkeit, die VerdĂŒnnung der sortierten Zellen und die BeschrĂ€nkung auf eine zu sortierende Zellpopulation.
1.2.2Optik
FĂŒr das Durchflusszytometer sind Charakteristika biologischer Einzelzellen oder Ă€hnlich groĂer Partikel als optische Eigenschaften wie Streu- und Fluoreszenzlicht detektierbar.
Das optische System eines Durchflusszytometers besteht aus der Anregungsseite und der Detektionsseite. Die typischerweise zur Anregung von Fluoreszenz bei der Durchflusszytometrie benutzten Laser strahlen Licht der folgenden WellenlÀngen ab (s. Abb. 1.3).
Abb. 1.3: GÀngige AnregungswellenlÀngen in der Durchflusszytometrie.
Ăber Prismen oder Zylinderlinsen wird aus dem runden Laserstrahl ein elliptischer Strahl geformt, der mit Hilfe einer Sammellinse in einem Punkt im Probenstrom gebĂŒndelt wird, um dort auf die fokussierten Zellen zu treffen (Interrogation Point â Analysepunkt; Abb. 1.4).
Ein elliptisches Strahlprofil ist in mehrerlei Hinsicht besser als ein rundes. Zum einen leuchtet ein solcher Strahl den ganzen Kernstrom aus, sodass Zellen auch dann gleichmĂ€Ăig beleuchtet werden, we...